中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

　　基于NGS平臺(tái)的BRCA檢測(cè)對(duì)醫(yī)生朋友距離很近又似乎很遠(yuǎn)：臨床實(shí)踐中檢測(cè)訴求很明確，但檢測(cè)過程像個(gè)黑匣子玄之又玄，讓不少人對(duì)檢測(cè)望而生畏。BRCA基因本身有什么特點(diǎn)？對(duì)應(yīng)于檢測(cè)有哪些合適的方法？流程有哪些關(guān)鍵步驟？哪些樣本可用于檢測(cè)？遺傳解讀需要達(dá)到什么水平才能保障結(jié)果的準(zhǔn)確性？為什么體細(xì)胞突變檢測(cè)目前那么少見？今天就來深入八一八，解答B(yǎng)RCA檢測(cè)中常見的疑惑。

　　1. BRCA1和BRCA2基因介紹

　　BRCA1和BRCA2是最早發(fā)現(xiàn)的直接與遺傳性乳腺癌有關(guān)的兩個(gè)基因。作為抑癌基因，兩者在調(diào)節(jié)細(xì)胞復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞的正常生長(zhǎng)方面起著重要作用。BRCA1/2基因序列很長(zhǎng)。具體來說，BRCA1長(zhǎng)81.2kb，由22個(gè)編碼外顯子組成，轉(zhuǎn)錄形成5.7kb的mRNA。BRCA2長(zhǎng)84.2kb，由26個(gè)編碼外顯子組成，mRNA長(zhǎng)為11kb。

　　根據(jù)BIC數(shù)據(jù)庫(kù)，BRCA1和BRCA2基因目前已報(bào)道的變異類型包括無義突變、移碼突變、非移碼插入、非移碼缺失、錯(cuò)義突變、同義突變、剪接位點(diǎn)突變，以及大片段的缺失或重排等，涉及到近4000個(gè)變異位點(diǎn)，而且這些突變分散遍布于各個(gè)外顯子，沒有證據(jù)表明存在突變熱點(diǎn)區(qū)域，只存在少數(shù)幾個(gè)相對(duì)高頻的變異位點(diǎn)。若用傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序、qPCR方法或MLPA等對(duì)BRCA1/2整個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，都不能一次性檢測(cè)BRCA1和BRCA2基因的所有變異類型，且需要耗費(fèi)大量的時(shí)間并且價(jià)格不菲。相比之下，高通量測(cè)序技術(shù)-二代測(cè)序技術(shù)以其更為高效快速且能一次性對(duì)BRCA1和BRCA2基因所有外顯子及鄰近上下游區(qū)域內(nèi)的變異同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以更高性價(jià)比的優(yōu)勢(shì)脫穎而出，成為BRCA1/2基因檢測(cè)市場(chǎng)的主力軍。

　　2. BRCA胚系突變檢測(cè)流程

　　利用二代測(cè)序技術(shù)開展BRCA突變篩查檢測(cè)，其流程復(fù)雜且專業(yè)性強(qiáng)(如下圖1)，對(duì)工作人員專業(yè)技術(shù)能力和檢測(cè)流程的技術(shù)操作、質(zhì)量控制的要求高。

　　圖1. BRCA胚系突變篩查檢測(cè)流程

　　在實(shí)驗(yàn)室人員能力方面，專業(yè)的技術(shù)人員是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的重要保障。需要對(duì)不同方向的技術(shù)人員分別進(jìn)行專業(yè)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)?zāi)芰?、生物信息分析能力和遺傳解讀能力等培訓(xùn)，技術(shù)人員獲得相應(yīng)的上崗證和資格證書后方可進(jìn)行相關(guān)操作執(zhí)行。

　　在檢測(cè)流程方面，實(shí)驗(yàn)室收到檢測(cè)樣本后，采用標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA。通常有2種方法構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)：一種是利用超聲波儀將基因組DNA打斷，進(jìn)行DNA建庫(kù)。再利用定制探針與標(biāo)記好的患者DNA文庫(kù)雜交，雜交結(jié)束后進(jìn)行洗滌和洗脫反應(yīng)，再經(jīng)PCR擴(kuò)增構(gòu)成測(cè)序文庫(kù)；另一種是設(shè)計(jì)BRCA基因特異的引物，用多重PCR的方法把BRCA基因上感興趣的區(qū)域擴(kuò)增，然后進(jìn)行加接頭、純化等反應(yīng)，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序文庫(kù)質(zhì)控合格后利用高通量測(cè)序儀讀出原始測(cè)序數(shù)據(jù)。測(cè)序完成后，數(shù)據(jù)分析流程見下圖2。

　　圖2.信息分析流程

　　首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，去除低質(zhì)量和接頭污染的“噪音”數(shù)據(jù)，然后將得到的無噪聲的數(shù)據(jù)與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)?；诒葘?duì)結(jié)果，進(jìn)行變異分析。最后，對(duì)檢測(cè)到的變異參考若干數(shù)據(jù)庫(kù)及查閱文獻(xiàn)進(jìn)行臨床意義解讀。

　　整個(gè)檢測(cè)流程每一個(gè)環(huán)節(jié)都需要設(shè)置相應(yīng)的技術(shù)操作規(guī)范，嚴(yán)格遵照技術(shù)操作程序執(zhí)行，并開展室內(nèi)質(zhì)量控制，參加國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。國(guó)家衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心于2015年10月首次組織開展了全國(guó)腫瘤診斷與治療高通量測(cè)序檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)測(cè)評(píng)活動(dòng)。此次測(cè)評(píng)活動(dòng)分胚系突變和體細(xì)胞突變兩個(gè)部分，胚系突變的合格率為84.1%，100%正確的實(shí)驗(yàn)室77.3%；體細(xì)胞突變的合格率僅51.2%，全對(duì)的實(shí)驗(yàn)室僅占16.7%。對(duì)于現(xiàn)今活躍的腫瘤診斷與治療高通量測(cè)序檢測(cè)市場(chǎng)，這無疑也敲響了警鐘，呼吁整個(gè)市場(chǎng)的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化。

　　此外，由于整個(gè)檢測(cè)流程繁瑣復(fù)雜，操作步驟繁多，為保障檢測(cè)結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性，有臨床意義的位點(diǎn)(致病和疑似致病的突變)都必須經(jīng)過區(qū)別于NGS平臺(tái)的另一平臺(tái)(如，Sanger和/或qPCR等)進(jìn)行驗(yàn)證。在經(jīng)歷了二十幾步嚴(yán)格質(zhì)量把控環(huán)節(jié)后，一份完整由專業(yè)解讀人員撰寫的BRCA基因檢測(cè)報(bào)告才會(huì)到達(dá)醫(yī)生手中，為患者提供準(zhǔn)確的基因參考信息。

　　介紹完BRCA基因檢測(cè)的整體流程，下面我們著重針對(duì)醫(yī)生朋友需要接觸到的兩個(gè)環(huán)節(jié)，樣品收集和報(bào)告解讀進(jìn)行介紹。

　　3.樣品收集

　　BRCA基因檢測(cè)的過程中，最基本的要素是樣本的可靠性。只有從最初保證樣本質(zhì)量以及準(zhǔn)確的臨床資料，才能獲得最為精準(zhǔn)的基因檢測(cè)結(jié)果。下面詳述BRCA基因檢測(cè)采樣時(shí)的注意事項(xiàng)。

　　首先，醫(yī)生需要與患者充分溝通，在患者充分理解基因檢測(cè)的價(jià)值、必要性并認(rèn)可基因檢測(cè)的情況下，方可進(jìn)行進(jìn)一步的填寫表單(包括申請(qǐng)單與知情同意書)以及采樣。申請(qǐng)單必須要包括受檢者姓名、年齡、性別、民族、籍貫、個(gè)人疾病史、家族疾病史等，以避免后期樣本混淆的可能，同時(shí)對(duì)于部分特殊、具有家族史的成員，出現(xiàn)較罕見的基因突變時(shí)信息也便于及時(shí)反饋給送樣醫(yī)生，為患者提供更為嚴(yán)格準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果以及更為科學(xué)的進(jìn)一步治療方案。知情同意書的意義在于給患者更為詳實(shí)的檢測(cè)介紹，進(jìn)一步理解基因檢測(cè)的內(nèi)容與意義，規(guī)避可能存在的倫理風(fēng)險(xiǎn)。

　　其次，采樣流程。過程包括樣本采集與樣本標(biāo)記。BRCA基因檢測(cè)多采用外周血樣本采集，少數(shù)會(huì)提供唾液、DNA樣品。

　　對(duì)于采集后的樣本，在采集管上貼上樣本唯一條碼，并注明受檢者姓名、年齡等信息；樣本交接單上必須標(biāo)有受檢者姓名或入庫(kù)編號(hào)、采樣日期，確保信息與申請(qǐng)單一致，以避免不必要的混淆可能。為保證運(yùn)輸過程樣品的保護(hù)，請(qǐng)選擇專業(yè)的物流機(jī)構(gòu)并嚴(yán)格按照要求完成。

　　4.遺傳報(bào)告解讀流程

　　遺傳報(bào)告解讀也具有一套嚴(yán)格的流程。原則上均以美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)院(ACMG)頒布的基因變異解讀和指南為解讀標(biāo)準(zhǔn)，首先利用公共和本地突變數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)變異頻率進(jìn)行過濾。經(jīng)過對(duì)功能預(yù)測(cè)分析軟件結(jié)果、數(shù)據(jù)庫(kù)記錄、文獻(xiàn)研究報(bào)道綜合考慮，并結(jié)合臨床表型，專業(yè)遺傳報(bào)告解讀人員會(huì)做出數(shù)據(jù)分析和解讀。遺傳分析解讀最終需要對(duì)篩選出來的突變進(jìn)行判定，按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院NIH的分類標(biāo)準(zhǔn)，遺傳性腫瘤易感突變分為五類，致病突變、疑似致病突變、意義未明突變、疑似良性突變及良性多態(tài)性。解讀報(bào)告除了對(duì)突變進(jìn)行健康等級(jí)分類外，也會(huì)為醫(yī)生及患者提供FDA批準(zhǔn)上市針對(duì)BRCA突變靶向藥物相關(guān)的信息(如針對(duì)BRCA基因突變的晚期卵巢癌患者治療，F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市的阿斯利康的奧拉帕利(Olaparib,商品名Lynparza)。嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化解讀流程以及具有資質(zhì)的專業(yè)遺傳信息解讀人員都是遺傳報(bào)告解讀必不可少的部分，解讀人員需要具備遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)或藥學(xué)專業(yè)背景，并且經(jīng)過專業(yè)的遺傳信息解讀培訓(xùn)以及實(shí)際解讀經(jīng)驗(yàn)，才能勝任這一工作。

　　5. BRCA體細(xì)胞突變檢測(cè)現(xiàn)況

　　在乳腺癌、卵巢癌中檢測(cè)到的BRCA 1/2突變，其中20%左右是由于體突變引起。體細(xì)胞突變的檢測(cè)需要正常組織做對(duì)照，常用血細(xì)胞做對(duì)照(如TCGA癌癥研究)。研究發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞突變與胚系突變的卵巢癌，乳腺癌病人在生存、預(yù)后方面沒有明顯的差異，并且都可以用奧拉帕利進(jìn)行治療。但是相對(duì)于胚系突變，體細(xì)胞突變檢測(cè)難度大些。檢測(cè)的難度和準(zhǔn)確性主要受樣本類型、癌癥細(xì)胞含量以及突變比例(具有BRCA 1/2體細(xì)胞突變的癌細(xì)胞占所有癌細(xì)胞的比例)等影響。因此，針對(duì)BRCA基因體細(xì)胞突變的檢測(cè)技術(shù)還在完善中。