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　　概述

　　在反相液相色譜中，死體積附近往往會(huì)形成一個(gè)或一些正的或者倒的色譜峰，這些色譜峰獨(dú)立于樣品而存在，可以統(tǒng)稱這些色譜峰為系統(tǒng)峰。一般地，系統(tǒng)峰的產(chǎn)生與所使用的色譜柱，流動(dòng)相添加劑以及起始有機(jī)相的比例有關(guān)。從經(jīng)典色譜塔板理論出發(fā)，流動(dòng)相經(jīng)泵混合經(jīng)由管路系統(tǒng)引入到色譜柱內(nèi)，流動(dòng)相內(nèi)的所有組分，均會(huì)在固-液兩相之間分配，直到平衡。而當(dāng)樣品或者其他與起始流動(dòng)相組成比例不同的溶液被注入色譜柱的時(shí)候，色譜柱頭部的各物質(zhì)的分配平衡被干擾，每種物質(zhì)的平衡狀態(tài)被干擾之后再次回復(fù)到平衡狀態(tài)的過程中，也就產(chǎn)生了系統(tǒng)峰，檢測(cè)到的系統(tǒng)峰的種類與多少和采用的檢測(cè)器的種類有關(guān)(如一些鹽離子在紫外檢測(cè)器上無法被檢測(cè)到，卻可以被CAD檢測(cè)器檢測(cè)到)。

　　如下圖1所示，流動(dòng)相為ACN：Water=4：96，添加劑TFA的濃度為0.1%，進(jìn)樣溶劑組成為ACN：Water=4.4：95.6，添加劑TFA的濃度為0.1%。圖中的正負(fù)色譜峰即為典型的系統(tǒng)峰。

　　反相液相色譜系統(tǒng)峰的影響因素

　　如前所述，反相色譜系統(tǒng)中，系統(tǒng)峰的形成與色譜柱，流動(dòng)相的組成特別是添加劑的種類以及濃度有關(guān)，此外配置樣品的溶劑的組成也是十分重要的因素。如下圖2A所示，流動(dòng)相的組成為乙腈與純水，添加劑為1：1的1,5-二氯蒽醌與1,8-二氯蒽醌，進(jìn)樣溶液為與流動(dòng)相比例相同的乙腈與純水；圖2B所示，流動(dòng)相的組成為乙腈與純水，進(jìn)樣溶液為1：1的1,5-二氯蒽醌與1,8-二氯蒽醌溶液。

　　由上圖2A與圖2B，1,5-二氯蒽醌與1,8-二氯蒽醌在兩張色譜圖中互為鏡像，此外區(qū)別還在與圖2A與圖2B中的兩個(gè)色譜峰的峰面積的絕對(duì)值的差異。上述現(xiàn)象，亦可說明反相液相色譜系統(tǒng)峰的形成與流動(dòng)相的組成以及樣品溶劑組成之間具有密不可分的關(guān)聯(lián)。

　　又如下圖3所示，流動(dòng)相為乙腈-水體系，流動(dòng)相中還添加有另外兩種添加劑，濃度分別為0.001 M，采用等度洗脫模式。該圖可以更加直觀地呈現(xiàn)多種添加劑存在的反相液相色譜中系統(tǒng)峰變化的概況。

　　一般地，當(dāng)我們對(duì)樣品進(jìn)行分析的時(shí)候，優(yōu)先使用流動(dòng)相溶解或者稀釋樣品，盡可能地減少由溶劑引起的一些不良的色譜現(xiàn)象(如溶劑效應(yīng)等)，此外也能夠減小進(jìn)樣操作對(duì)于色譜平衡狀態(tài)的干擾程度。但在醫(yī)藥工藝以及藥物分析過程中，醫(yī)藥中間體以及終產(chǎn)品多含有酸/堿官能團(tuán)，為了獲得優(yōu)異的色譜峰峰形，流動(dòng)相中往往會(huì)添加有機(jī)酸堿添加劑甚至需要使用不同種類、不同pH的緩沖鹽作為添加劑。由于各種添加劑的使用，導(dǎo)致流動(dòng)相的組成比較復(fù)雜，且各組成成分在色譜柱固定相以及流動(dòng)相之間分配并達(dá)到平衡。

　　為了充分減少溶劑組成與流動(dòng)相的組成不同引起的諸如溶劑效應(yīng)等一系列問題，我們會(huì)盡可能的使用流動(dòng)相作為溶劑，但有的時(shí)候，待分析化合物對(duì)于酸或者堿性環(huán)境不穩(wěn)定，這時(shí)為了保證樣品分析時(shí)效內(nèi)的穩(wěn)定性，不可避免地要使用與流動(dòng)相不同的溶劑來溶解樣品。除此之外，一些難溶性的樣品，有時(shí)候會(huì)使用到DMSO或者DMF作為助溶劑，而與此同時(shí)，我們不可能在流動(dòng)相中添加這些助溶劑，這也導(dǎo)致溶解樣品的溶劑與流動(dòng)相的組成不同的情形。

　　以上，我們也只是針對(duì)等度洗脫模式進(jìn)行的討論，而對(duì)于梯度洗脫模式，流動(dòng)相中的各種組成成分的分配平衡過程就要復(fù)雜的多。因此系統(tǒng)峰的出現(xiàn)，基本不可避免，特別是使用酸堿等具有強(qiáng)紫外吸收的添加劑，緩沖鹽以及離子對(duì)試劑的時(shí)候。

　　反相液相色譜系統(tǒng)峰的個(gè)數(shù)

　　一般地來說，按照反相液相色譜系統(tǒng)峰理論，反相液相色譜流動(dòng)相的組成為N的話，如果檢測(cè)器允許，將可檢測(cè)到N-1個(gè)系統(tǒng)峰，而系統(tǒng)峰的正負(fù)，與檢測(cè)手段有關(guān)。

　　如下圖所示，流動(dòng)相組成為乙腈：水=4：96，其中添加TFA，濃度為0.1%；樣品為空白，其組成為乙腈：水=4.4：95.6，其中添加TFA，濃度為0.1%。從下圖中，我們看到有四個(gè)色譜峰，依次為死體積處色譜峰，溶解氧色譜峰，TFA與乙腈的疊加色譜峰以及添加劑TFA引起的空穴效應(yīng)倒色譜峰。

　　此外，從圖中也可以看出，TFA與乙腈的疊加色譜峰面積的絕對(duì)值要大于添加劑TFA引起的空穴效應(yīng)倒色譜峰面積的絕對(duì)值，其原因也顯而易見，在扣除乙腈所引起的色譜峰面積之后，二者面積的絕對(duì)值，在理論上講，應(yīng)該是一致的。

　　如上圖實(shí)例，流動(dòng)相中有水，乙腈，TFA以及溶解氧，共四種組分，而在色譜圖上卻只看到2個(gè)色譜峰(最后一個(gè)為空穴效應(yīng)倒色譜峰)。這是由于TFA在普通的C18色譜柱上容量因子較小，基本不能做到較有效的保留，引起與乙腈色譜峰的重疊，導(dǎo)致實(shí)際觀察到的系統(tǒng)色譜峰個(gè)數(shù)減少的現(xiàn)象。

　　反相液相色譜系統(tǒng)峰的形成的理論解釋

　　按照色譜塔板理論，將色譜柱等效為有限元個(gè)塔板，溶質(zhì)在各塔板內(nèi)均要達(dá)到分配平衡，經(jīng)過適當(dāng)演化，可得到下述兩個(gè)數(shù)學(xué)模型，如下圖5。

　　其中，mm為平衡時(shí)流動(dòng)相中的溶質(zhì)質(zhì)量，k’為溶質(zhì)的容量因子，ms為平衡時(shí)固定相中的溶質(zhì)質(zhì)量，mtotal為總質(zhì)量；上角標(biāo)t為任一時(shí)刻，下角標(biāo)i為任一塔板。

　　假設(shè)流動(dòng)相的組成為乙腈與水，其中添加0.1%的TFA，使用前經(jīng)超聲處理，將上述模型做以改變，如下圖6所示

　　在這里，首先假定乙腈在很小的變化范圍內(nèi)的時(shí)候，其分配系數(shù)維持常數(shù)，而TFA的分配系數(shù)則與乙腈的濃度呈現(xiàn)線性相關(guān)的關(guān)系。按照上述模型進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬，流動(dòng)相組成為乙腈：水=4：96，添加劑為0.1%的TFA。

　　如上圖7A所示，紅色為進(jìn)樣乙腈：水=4.4：95.6，含有0.1%TFA的空白溶液，藍(lán)色為進(jìn)樣乙腈：水=4.4：95.6，綠色為乙腈：水=4：96，添加劑為0.1%的TFA；上圖7B則為，紅色為進(jìn)樣乙腈：水=3.6：96.4，含有0.1%TFA的空白溶液，藍(lán)色為進(jìn)樣乙腈：水=3.6：96.4，綠色為乙腈：水=4：96，添加劑為0.1%的TFA。

　　上圖7A與7B的區(qū)別在于乙腈引起的色譜峰的正負(fù)性以及TFA的色譜峰及其引起的空穴效應(yīng)色譜峰的先后關(guān)系。其中圖7A與圖4的實(shí)際色譜狀況完全一致。

　　此外也可直觀地對(duì)上述模擬結(jié)果進(jìn)行解釋，如對(duì)于圖7A，進(jìn)樣溶液的乙腈的組成比流動(dòng)相的組成要高0.4%，由于一定的小范圍內(nèi)乙腈的分配系數(shù)近似于常數(shù)，高濃度的乙腈色譜帶經(jīng)色譜柱后形成正色譜峰。對(duì)于TFA，雖然進(jìn)樣溶液與流動(dòng)相中的濃度均為0.1%，但是TFA的分配系數(shù)隨乙腈濃度的變化而線性改變，當(dāng)高濃度的乙腈溶液被注入色譜柱之后，由于該色譜帶的乙腈濃度高，TFA在固定相內(nèi)的分配相應(yīng)減少而導(dǎo)致檢測(cè)器處檢測(cè)到正峰，在該進(jìn)樣色譜帶之后，乙腈的濃度得到重新恢復(fù)，固定相中的TFA的分配勢(shì)必得到增加，在檢測(cè)器處形成空穴效應(yīng)倒峰，如果仔細(xì)比較可以發(fā)現(xiàn)二者的紫外吸收光譜互為鏡像。

　　如前所述，TFA基本不被C18色譜柱保留的特性，導(dǎo)致出峰位置與乙腈重合，可以使用PFBA作為相應(yīng)的添加劑，其他條件不變，對(duì)系統(tǒng)峰進(jìn)行指認(rèn)(PFBA能夠被有效保留)，如下圖8所示。

　　P1色譜峰為乙腈色譜峰，P2色譜峰為PFBA色譜峰，P3為溶氧色譜峰，P4為PFBA引起的空穴效應(yīng)的倒峰，且其面積的絕對(duì)值與PFBA色譜峰面積的絕對(duì)值相等。

　　以上為等度模式下，系統(tǒng)峰所具有的特點(diǎn)及其形成原因。在梯度模式下就相對(duì)比較復(fù)雜了。與等度模式下一樣，同樣與色譜柱的類型以及流動(dòng)相的組成以及配樣溶液的組成有很大的關(guān)系。一般地，對(duì)于強(qiáng)紫外吸收的添加劑，隨著梯度的運(yùn)行，早期色譜圖上多會(huì)形成一個(gè)比較突出的色譜平臺(tái)或鼓包。

　　反相液相色譜中的系統(tǒng)峰，一般是獨(dú)立于樣品而存在的，其形狀及形成的原因與流動(dòng)相的組成，色譜柱的類型以及配制樣品所用的溶劑有關(guān)。系統(tǒng)峰的形成，可按照經(jīng)典色譜塔板理論輔助計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行解釋，也可以根據(jù)分配-平衡進(jìn)行簡(jiǎn)單描述。然而，在梯度洗脫模式下，系統(tǒng)峰的形狀以及形成原因還與梯度的斜率以及方法前平衡時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。