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醫(yī)療器械的細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法

嘉峪檢測網(wǎng) 2018-03-19 08:54

[摘要]：依據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，介紹醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)的凝膠限度試驗(yàn)方法和注意事項(xiàng)。

[關(guān)鍵詞]：內(nèi)毒素、鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)、鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)、凝膠限度試驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)毒素限值、凝膠法、濁度法和顯色基質(zhì)法、鱟試驗(yàn)微生物快速檢測系統(tǒng)

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。

1.醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

（1）GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法 [1]；

（2）2015年版《中國藥典》1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 [2]。

2.醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素所需主要設(shè)備

（1）電熱干燥箱，溫度達(dá)到 250 ℃，用于除外源性內(nèi)毒素。
（2）旋渦混合器。
（3）試管恒溫儀、恒溫水浴箱或適宜的恒溫器，可設(shè)定溫度為（37±1）℃。
（4）天平，精度為 0.1 mg 以下。
（5）鱟試劑，應(yīng)具有國家主管部門的批準(zhǔn)文號。
（6）細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)具有國家主管部門的批準(zhǔn)文號。
（7）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水應(yīng)符合滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005 EU/ml（用于光度測定法），且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用。

（8）實(shí)驗(yàn)用具：剪刀、砂輪、試管、三角瓶、試管架、洗耳球、封口膜、75% 乙醇棉、時(shí)鐘、移液管（或刻度吸管）、凝集管（10 mm×75 mm）、微量加樣器及無熱原吸頭。耐熱器皿須經(jīng)250℃干烤至少30min。若使用與微量加樣器配套的吸頭等塑料器具時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器械。

3.試驗(yàn)準(zhǔn)備

3.1 玻璃器皿的洗滌
將玻璃器皿放入鉻酸洗液中充分浸泡，然后取出將洗液控干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗3 遍以上，控干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放入電熱干燥箱。
3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素
玻璃器皿置電熱干燥箱后，待干燥箱溫度升至250 ℃后開始計(jì)時(shí)，干烤30 min以上。達(dá)到規(guī)定時(shí)間后，關(guān)斷電源，待干燥箱溫度自然降至室溫。
3.3 供試品溶液的制備
供試品應(yīng)使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為浸提介質(zhì)，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的 pH值為6.0~8.0為宜。采用無熱原氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)供試液的pH值。無熱原氫氧化鈉或鹽酸溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。也可使用不含內(nèi)毒素和干擾因子且經(jīng)過驗(yàn)證的緩沖液。

4.凝膠法操作方法

利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的機(jī)制，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。如經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)供試品對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)有不能排除的干擾作用則不適宜采用本試驗(yàn)。本試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止內(nèi)毒素的污染。

4.1鱟試劑靈敏度復(fù)核

在使用一批新的鱟試劑進(jìn)行供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查或供試品干擾試驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)室必須進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。目的為考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確，同時(shí)也考查檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及試驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。

4.1.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備(按說明書，略）

4.1.2 待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備(按說明書，略）
4.1.3 加樣(按說明書，略）
4.1.4觀察并記錄結(jié)果
將試管架從水浴或恒溫器中輕輕取出，避免振動(dòng)，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn) 180°觀察，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（＋）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。

4.1.5 試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

4.1.6 結(jié)果判斷

當(dāng)λc 在 0.5~2.0 λ（包括 0.5 λ 和 2.0 λ）時(shí)判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾試驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以λ（標(biāo)示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。

4.1.7 舉例

4.2干擾試驗(yàn)

目的是檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。

4.3供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[3-4]

在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時(shí)每次試驗(yàn)須做2支陽性對照和2支陰性對照。

注意事項(xiàng)

（1）試驗(yàn)前，須用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒，試驗(yàn)操作應(yīng)在清潔環(huán)境中進(jìn)行，過程中應(yīng)防止內(nèi)毒素的污染。

（2）在使用洗耳球、移液管取樣時(shí)，應(yīng)注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內(nèi)毒素進(jìn)入供試液。
（3）試驗(yàn)所用器具經(jīng)250℃干烤30min以上，要待烤箱溫度升至250℃后開始計(jì)時(shí)。在不打開金屬容器的情況下，可在2d內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤。
（4）開啟細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑時(shí)，先輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開，啟開過程中應(yīng)防止玻璃碎片落入瓶內(nèi)。
（5）無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中須嚴(yán)格控制產(chǎn)品初始污染菌，以免導(dǎo)致滅菌后產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo)超過限值。
（6）對于非液態(tài)產(chǎn)品企業(yè)制定產(chǎn)品技術(shù)要求時(shí)，如按EU/ml規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素限值在試驗(yàn)方法中則需明確產(chǎn)品的浸提液體積。
（7）按GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第 2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法進(jìn)行供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)時(shí)，供試液應(yīng)在（37±1）℃恒溫箱中浸提不小于 1h，供試液貯存應(yīng)不超過2h。
（8）溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時(shí)，不要?jiǎng)×艺袷幈苊猱a(chǎn)生氣泡；試驗(yàn)過程中應(yīng)注意更換吸頭，以避免檢查用水的污染及溶液的交叉污染。
（9）由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過程中及觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)注意不要使試管受到振動(dòng)，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
（10）進(jìn)行干擾試驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)對照系列和含內(nèi)毒素的供試品溶液系列應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；如經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)供試品對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)有不能排除的干擾作用則不適宜采用凝膠限度法。
（11）在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)中要求的對照應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并在試驗(yàn)有效的情況才能進(jìn)行計(jì)算和判斷。
（12）對于一個(gè)初包裝內(nèi)有多組件的成套器械，如規(guī)定的內(nèi)毒素限值是針對成套器械的，可以用一份浸提液對所有組件浸提，也可將各組件分別浸提后混合，各組件所用的浸提液總體積應(yīng)不超過MVD，當(dāng)組合后樣品出現(xiàn)結(jié)果不確定時(shí)，則需分別檢驗(yàn)各組件，以研究各組件的污染源。
（13）如一個(gè)初包裝產(chǎn)品為多個(gè)醫(yī)療產(chǎn)品的集合，在臨床應(yīng)用中每種醫(yī)療器械獨(dú)立使用，則應(yīng)有各自的產(chǎn)品內(nèi)毒素限值，且應(yīng)分別進(jìn)行試驗(yàn)和評價(jià)。
（14）2015年版《中國藥典》1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。

作者：潘四春，聶濤，金國勝，張娟

北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所

來源：AnyTesting

醫(yī)療器械的細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法

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