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近期受木木兄的邀請，寫一篇關(guān)于技術(shù)方面的小文，說真的很激動，這算是對于本人技術(shù)的一種認(rèn)可。想想在蛋白免疫診斷這個領(lǐng)域摸爬滾打混跡了8年，感覺現(xiàn)在的一切是那么的不易，那么的周折。

依稀記得08年正式開始蛋白診斷試劑盒的研發(fā)，說實話，那時候更多的是彷徨、無助，勝于新鮮感。最大的原因在于實驗設(shè)計經(jīng)驗基本為零，技術(shù)開發(fā)能力基本為零?；蛟S后續(xù)的各位研友們有自己的理論知識和所謂的經(jīng)驗之道，但是，本人在此善意提醒一句，除非您已經(jīng)真的從實踐中形成了一套自有的研發(fā)思路，要么您擁有堅強(qiáng)的后盾導(dǎo)師，否則，請務(wù)必沉浸下來，好好的理清楚自己的思路。

具體思路的培養(yǎng)和形成我在此就不多說了，僅從我個人角度聊下研發(fā)的大體思路環(huán)節(jié)，或許各位大大看的索然無味，再次抱歉。若是您有興趣愿意賞臉觀摩下我的歷程，那就請繼續(xù)下看。

很多新人進(jìn)入單位，開始一個項目研發(fā)，或許都會跟我當(dāng)初一樣擁有迷茫感，那么請靜心做好以下幾個準(zhǔn)備：

1.請先大量查閱文獻(xiàn)，做到對該項目涉及的標(biāo)志物特性了如指掌，比如說：該物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)/空間結(jié)構(gòu)，物理/化學(xué)性質(zhì)；

2.該標(biāo)志物在臨床中的診斷意義，該標(biāo)志物涉及的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等確立該標(biāo)志物的基本性能指標(biāo)等信息；

3.準(zhǔn)備好以上資料并逐一理解之后，下面就開始研發(fā)工藝思路的設(shè)計。

針對3點，我舉一個常規(guī)例子來說明：比如咱們開發(fā)某一蛋白標(biāo)志物，如HCG（該標(biāo)志物為目前很成熟的一種產(chǎn)品，技術(shù)門檻較低，抗體原料也很容易獲得），在您已經(jīng)準(zhǔn)備好我所說的1.和2.之后已經(jīng)知道該標(biāo)志物為一個大分子物質(zhì)，按照免疫學(xué)診斷方法學(xué)構(gòu)造劃分應(yīng)使用雙抗體夾心法，那么下一步我們就知道了，先去市場找該標(biāo)志物的抗體原料，最好的是有原料商給您提供配對好的抗體對，為什么這么說？因為對于你所找到的抗體，若是單個的原料，下一步您就需要多一步驟，即抗體配對，特別是對于新入行的兄弟們，這塊工作對于操作手法及配對方案的設(shè)計可能相對較為稚嫩，所以最好的就是讓原料商幫你把這部分工作做好，也減少了您的研發(fā)周期，另外，從原料后期采購來說，對于原料商，您購買的品種和數(shù)量越多，給予您的折扣也相對理想，進(jìn)一步可以降低試劑盒開發(fā)成本。當(dāng)然，事無全是，具體情況還需具體分析。特此提醒：有一些新標(biāo)志物產(chǎn)品特別是在剛上市之時，其實原料提供商真的很少，這個時候您就需要發(fā)揮極限能力，利用一切可利用資源，進(jìn)行全球搜捕吧，哈哈，或許運氣好可以找到，對此尋求到的原料也很少有配對原料提供，若此，那只能遺憾的跟您說，您準(zhǔn)備著手做下原材料配對工作吧！原料配對里面涉及的內(nèi)容太多，在此就不多敘說了，若有興趣，咱們私下可慢聊。。。。。。

在此提醒各位研友，尋找的原料不能只有一家，至少需要找到3家以上，因為后面有一項很重要的工作需要你做，即：原材料篩選。最終獲得的適合您技術(shù)平臺的原料最好是為2家，一家以注冊申報為主，另一家作為您產(chǎn)品后期的備份原料供應(yīng)，這樣對于后期上市產(chǎn)品供應(yīng)的穩(wěn)定性有很大幫助。畢竟現(xiàn)在企業(yè)的競爭都很激烈，說不得等您產(chǎn)品開發(fā)出來再回頭去找該原料商發(fā)現(xiàn)已經(jīng)不存在，那就糗大了。注意一點：在尋找原料時候必須是原料商提供的原料信息中原料適用平臺里包含或者接近您的技術(shù)平臺，這一點至關(guān)重要！

上面說了這么多，其實就是一個目的：為下面的正式研發(fā)工作做好鋪墊。在您尋找到對應(yīng)原料之后，第一步需要做的就是測試原料，一般原料到了之后需要先進(jìn)行初步性能評定，這個是需要結(jié)合您所設(shè)計的或者您所在單位所擁有的技術(shù)平臺進(jìn)行綜合評估的。初步性能評定無非就是定量產(chǎn)品做下線性梯度、靈敏度等等，定性產(chǎn)品看下cut-off值附近的灰區(qū)范圍等等，每個研友都有自己的評定設(shè)想。具體內(nèi)容我就不累述了，嘿嘿，歡迎私下詳聊。

在您初步篩選出相對合適的原料后，那么下一步就是將該原料使用到您的技術(shù)平臺上，若是單位的技術(shù)平臺已經(jīng)很成熟，那就按照企業(yè)的技術(shù)平臺操作流程對應(yīng)的一步步去匹配試用即可；若是新平臺，那就要考慮幾個問題，后期的各種不同標(biāo)志物如何磨合進(jìn)某一技術(shù)平臺中，這個時候需要做的就不是去匹配技術(shù)平臺，而是先各自按照一個大方向，大框架去獨自產(chǎn)品開發(fā)。在您設(shè)定的操作步驟里，不乏以下幾步：捕獲抗體的包被（包被的介質(zhì)如：ELISA板、化學(xué)發(fā)光板、磁微粒等）、識別抗體的標(biāo)記（標(biāo)記手法如：HRP/ALP酶促、HRP/ALP酶發(fā)光、吖啶酯/SA等化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)等）、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/質(zhì)控品等購買/制備等，我說的這些是最基本的平臺所涉及的。甚至有些平臺涉及到放大系統(tǒng)（一般使用生物素放大系統(tǒng)較多）或者上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)等等。說了這些，其實就是一個目的，在做產(chǎn)品前，先初步制定好自己的平臺流程，對應(yīng)的流程里涉及的試劑/物質(zhì)，相應(yīng)的去包被/標(biāo)記/處理等。

做好以上的，那就開始您的正式研發(fā)工作吧，將您準(zhǔn)備好的每一種物質(zhì)帶入某個制定步驟中，初期使用的抗體原料濃度一般有兩種選擇：第一種就是原料商給予的信息，建議濃度范圍，您可以嘗試；第二種就是常規(guī)的按照1ug/ml包被捕獲抗體、1:2000稀釋標(biāo)記抗體，當(dāng)然這些都是經(jīng)驗值，不適用于所有產(chǎn)品，具體產(chǎn)品還需要綜合很多信息；比如我經(jīng)歷過的某些產(chǎn)品，對應(yīng)的初步使用濃度一個為15ug/ml（EISPOT平臺）、一個為3ug/ml（ELISA平臺），這些是需要結(jié)合你所使用的平臺特性以及原料物質(zhì)本身特性決定，綜合信息去考慮去衡定。甚至我做過的某產(chǎn)品原料用到了1mg/ml濃度（POCT平臺），雖然濃度高，但單檢測使用量少。。。。。。這里我就不多說了。

在您初步摸索過的濃度做了技術(shù)流程之后，你極有可能會遇到很多現(xiàn)象，比如：無數(shù)值（反應(yīng)孔值與陰性孔值一致）或者全部高值（陰性孔與反應(yīng)孔的數(shù)值一致都為很高的值），諸如此類問題的原因排查：

無數(shù)值，考慮所使用的buffer體系是否合理，孵育時間，洗板操作等等，導(dǎo)致蛋白在操作過程中丟失，還有一個問題需要重視，就是位阻問題，排查下使用的封閉系統(tǒng)是否存在導(dǎo)致位阻原因的大分子物質(zhì)存在？另外在封閉體系和包被緩沖液中是否存在導(dǎo)致蛋白物質(zhì)與反應(yīng)介質(zhì)去離子化物質(zhì)？各反應(yīng)體系緩沖液的pH值也是一個很重要的環(huán)節(jié)；

高值，考慮的幾大方面包括：操作是否存在交叉污染？比如洗滌？比如加樣使用槍頭未更換？是否存在洗滌操作不徹底？是否存在洗滌液成分問題？等等。

在您基本摸索出反應(yīng)濃度成梯度時（梯度計算可一次項直線計算、也可擬合各種曲線如：二次項、雙對數(shù)等等，但是每種不同線性有對應(yīng)的數(shù)據(jù)指標(biāo)，可查閱相關(guān)資料），恭喜您，可以進(jìn)入下一步操作，工藝優(yōu)化，即：將您前期所操作的步驟，每一步驟，每一組份，去進(jìn)一步精化操作，最終獲得一個能夠讓您得到最優(yōu)檢測結(jié)果的所謂最優(yōu)化操作步驟。這一大塊，我也不累述了。很多細(xì)節(jié)是需要經(jīng)驗積累的。但是新手們，只需要記住一個準(zhǔn)則：在確保自己操作手法的盡量標(biāo)準(zhǔn)外，每一環(huán)節(jié)做到大膽假設(shè)，小心求證即可。并且在研發(fā)工作期間，逐步積累經(jīng)驗，遇到細(xì)節(jié)問題多問多看，多翻閱相關(guān)資料文獻(xiàn)，最終能夠獲得一個屬于自己特色的研發(fā)思路和體系，而這才是您在研發(fā)之路走得更遠(yuǎn)更久的硬東西！

以上內(nèi)容寫的很亂很碎，只是粗略的談下我本人對于研發(fā)初期的各位戰(zhàn)友的一些想法，希望能夠有點小用處。其實研發(fā)思路和自身研發(fā)體系，每個人都是各異的，一個產(chǎn)品的形成，需要研發(fā)技術(shù)、需要質(zhì)量體系、需要法規(guī)約束等等，這是IVD產(chǎn)品的特色。質(zhì)量體系也好，法規(guī)也罷，其實他們都是一個框架、一種約束，約束著產(chǎn)品技術(shù)的合理開發(fā)、臨床的合理使用等，但是這僅僅是一個框架，實質(zhì)內(nèi)容還是需要研發(fā)人員去填補(bǔ)，至于如何將一個產(chǎn)品做到豐滿有肉，那就需要各位研發(fā)大大們各顯神通，而這也正是研發(fā)工作人員的目標(biāo)。

此文就當(dāng)是開篇吧，后續(xù)若有機(jī)會，我會就每一研發(fā)環(huán)節(jié)詳細(xì)聊下研發(fā)體系中可能會碰到的一些現(xiàn)象及處理方式等，意在能夠與各位研友互動。若有不足或錯誤之處，敬請批評指正。研發(fā)之路慢慢兮，研發(fā)同道須上下而求索！