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引  言

強制降解試驗到底應(yīng)該怎么做才合適？

具體的操作細(xì)節(jié)應(yīng)該如何執(zhí)行？

符合FDA要求的穩(wěn)定性指示方法建立的具體步驟是什么？

這是很多從事質(zhì)量研究的人員都想弄明白的問題，《Development of forced degradation and stability indicating studies of drugs-A review》一文給出了答案。

1. 前言

藥物分子的化學(xué)穩(wěn)定性是一個非常值得關(guān)注的問題，因為它會影響藥物產(chǎn)品的安全性和有效性。了解分子的穩(wěn)定性有助于選擇合適的配方和包裝，并提供合適的貯存條件及有效期。強制降解試驗是在比加速試驗條件更劇烈的條件下研究藥物的降解途徑與降解產(chǎn)物，從而確定分子的化學(xué)穩(wěn)定性的方法。ICH指導(dǎo)原則指出，強制降解試驗旨在識別可能的降解產(chǎn)物，建立降解途徑，明確分子的化學(xué)穩(wěn)定性，并驗證所選擇的穩(wěn)定性指示方法（1）。但是這些指導(dǎo)原則只是概括性的論述，并沒有提供具體操作的細(xì)節(jié)。

新藥申報中要求提交長期試驗（12個月），加速試驗（6個月）或中間條件（6個月）的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，因此對降解雜質(zhì)的分離、鑒定、定量研究所需的時間會很長。強制降解試驗在很短的時間，如幾周內(nèi)就可以產(chǎn)生降解雜質(zhì)，有助于雜質(zhì)的研究。強制降解試驗可以用來開發(fā)用于加速長期試驗的穩(wěn)定性指示方法，本文對強制降解試驗的設(shè)計及其在開發(fā)穩(wěn)定性指示方法方面的應(yīng)用，提出了一些重要建議，值得借鑒和思考。

2.強制降解試驗的目的是什么？

建立原料藥和制劑的降解途徑

區(qū)分配方中與制劑相關(guān)和不相關(guān)的降解產(chǎn)物

闡明降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

確定處方中原料藥的內(nèi)在穩(wěn)定性

揭示原料藥和制劑的水解、氧化、熱解或光解等降解機制（1，2）

建立穩(wěn)定性指示方法

了解藥物分子的化學(xué)性質(zhì)

確定更加穩(wěn)定的處方

產(chǎn)生一個與ICH正式穩(wěn)定性試驗相似的降解雜質(zhì)譜

解決穩(wěn)定性試驗中有關(guān)的問題（3）

3.何時進(jìn)行強制降解試驗的研究？

在新藥和仿制藥研發(fā)中了解何時進(jìn)行降解試驗是很重要的。FDA建議在phase III階段進(jìn)行降解試驗。對于API，應(yīng)進(jìn)行不同pH溶液、氧氣和光照、高溫高濕條件下的降解試驗。采用一批樣品進(jìn)行，結(jié)果在年報中進(jìn)行提交（4）。然而，在preclinical phase或phase I階段非常鼓勵對API進(jìn)行降解試驗研究，目的是有足夠的時間來確定降解產(chǎn)物、結(jié)構(gòu)確證、優(yōu)化降解條件。一個早期的降解研究對于API生產(chǎn)工藝的改進(jìn)以及選擇恰當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性指示方法也具有一定意義（5，6）。

4.降解多大程度才合適呢？

降解多少才合適這一問題在藥學(xué)研究人員中是一個經(jīng)常討論的問題。在色譜分析方法中一般認(rèn)為降解5%-20%是合理的，對于分析方法驗證來說降解10%為最優(yōu)（7,8）。有些科學(xué)家認(rèn)為對于含量下限為90%的小分子藥物來講10%的降解程度是最佳的。有其他科學(xué)家建議可在API中加入降解雜質(zhì)在制劑的穩(wěn)定性考察過程中監(jiān)控其穩(wěn)定性（2）。

沒必要強求強制降解試驗一定要產(chǎn)生降解產(chǎn)物。如果在加速穩(wěn)定性方案中的降解條件下API或制劑沒有降解，那么降解研究可以終止（11）。這說明產(chǎn)品具有良好的穩(wěn)定性。過度降解可能導(dǎo)致二級降解產(chǎn)物，而這在產(chǎn)品的儲存期間可能并不會產(chǎn)生（12）。由于制劑中的輔料和主藥濃度與API不同，因此制劑的產(chǎn)生降解雜質(zhì)的方案可能與API是不同的。推薦在溶液中進(jìn)行最長為14d的降解試驗（氧化降解試驗最長24h），為方法開發(fā)提供降解樣品（13）。

5.如何設(shè)計降解條件（策略）？

降解條件的選擇應(yīng)與產(chǎn)品在正常生產(chǎn)條件、貯藏、使用條件相關(guān)，因藥而異（9）。對于API和制劑，通常的降解方案如下流程圖所示：

降解條件最少應(yīng)包括酸堿水解、熱、氧化、光照（5,14-16）、還可能有凍融循環(huán)等（10）。指導(dǎo)原則中沒有pH、溫度、氧化劑的特別規(guī)定。光降解試驗的設(shè)計是根據(jù)ICHQ1B中的光源應(yīng)包括可見光和紫外光（UV，320-100nm）（11）。最初目標(biāo)是找到使API產(chǎn)生大約10%降解的條件。降解試驗中最常用的降解條件見表1（17）。

一些科學(xué)家發(fā)現(xiàn)開始時使用80℃條件或更高條件在短時間（2,5,8,24h等）多個時間點測定降解率是很實用的（18），主要降解雜質(zhì)和次級降解雜質(zhì)會通過早期時間的檢測進(jìn)行區(qū)分開來，有助于更好的理解降解途徑。還有一種方法是使用API按表1中的條件開始降解，然后根據(jù)情況增加或降低條件來獲得足夠的降解。與劇烈條件和短時間方法相比，這種降解策略較好，理由是：

    （i）當(dāng)使用劇烈條件時降解機理可能發(fā)生改變；

    （ii）當(dāng)使用高濃度反應(yīng)試劑，如酸、堿等，在進(jìn)行HPLC 分析時，樣品可能需要中和或稀釋。

這些原因說明，降解時應(yīng)盡可能采用正常條件進(jìn)行（19）。當(dāng)處方或方法發(fā)生變更時，應(yīng)重新進(jìn)行降解試驗，因為這些變更可能導(dǎo)致新的降解雜質(zhì)出現(xiàn)。

6.樣品濃度選擇多少合適？

降解試驗中采用何種濃度？目前指導(dǎo)原則中沒有規(guī)定。文獻(xiàn)推薦采用1mg/ml作為起始研究濃度（20），這通?？梢垣@得很小的降解雜質(zhì)。有些降解研究建議在最終處方濃度下進(jìn)行（19），如aminopenicillins 和aminocephalosporins在最終商業(yè)處方中濃度很高，會產(chǎn)生一系列的聚合物雜質(zhì)（21）。

7.降解條件分析                            

7.1水解降解

水解是在較寬pH范圍內(nèi)進(jìn)行的一個最常見的化學(xué)降解反應(yīng)，包括化合物與水的反應(yīng)。酸和堿的水解反應(yīng)涉及分子中基團(tuán)的離子化。酸堿降解包括藥物與酸或堿接觸后產(chǎn)生主要降解雜質(zhì)。酸或堿的種類和濃度的選擇取決于藥物的穩(wěn)定性。一般選擇鹽酸或硫酸(0.1-1M)為酸水解和氫氧化鈉或氫氧化鉀(0.1-1M)作為堿水解的條件（20,22）。如果化合物難溶于水，可加入其他助溶劑使其在鹽酸或氫氧化鈉溶液中溶解。助溶劑的選擇應(yīng)基于藥物的結(jié)構(gòu)。降解試驗一般從室溫開始，如果沒有降解，則提高溫度為50-70℃。降解不應(yīng)超過7d。降解樣品用適當(dāng)?shù)乃?、堿或緩沖液中和，以避免進(jìn)一步發(fā)生降解。

7.2氧化降解

過氧化氫被廣泛用于藥物的氧化降解研究中，但其他氧化劑如金屬離子、氧氣和自由基引發(fā)劑（azobisisobutyronitrile，AIBN，偶氮二異丁腈）也可以使用。氧化劑的種類、濃度、氧化條件的選擇取決于藥物本身。文獻(xiàn)報道樣品采用0.1-3%過氧化氫溶液在中性pH條件、室溫下放置7d或者最大產(chǎn)生20%的降解可能會生產(chǎn)相關(guān)降解雜質(zhì)（22）。藥物的氧化降解涉及電子轉(zhuǎn)移機理，形成陰離子和陽離子。胺、硫化物和苯酚易受電子轉(zhuǎn)移氧化產(chǎn)生N -氧化物、羥胺、砜和亞砜（23）。不穩(wěn)定氫如芐基碳、烯丙基碳、和叔碳或α-位氫原子容易氧化形成氫過氧化物、羥基或酮（24,25）。

7.3光降解

藥物的光降解試驗應(yīng)證明對光不會發(fā)生變化。光降解試驗應(yīng)將藥物置于UV或熒光條件下產(chǎn)生主要降解雜質(zhì)。推薦條件見ICH指導(dǎo)原則（11）。原料或固體/液體制劑應(yīng)采用1.2 million lx h和200Wh/m2的光進(jìn)行研究。通常采用300-800nm波長進(jìn)行光降解（26, 27）。最大光照強度為6 million lx h（25）。光降解可通過自由基機制誘導(dǎo)產(chǎn)生光氧化。羰基、硝基芳烴、N-氧化物、烯烴、芳基氯化物、弱C–H和O–H鍵、硫化物和多烯可能產(chǎn)生藥物的光敏性（28）。

7.4熱降解

熱降解(例如，干熱和濕熱)應(yīng)該在比ICH Q1A規(guī)定的加速條件更劇烈的情況下進(jìn)行。固態(tài)的原料和制劑樣品應(yīng)該在干熱和濕熱的條件下進(jìn)行研究；而液體制劑應(yīng)在干熱條件下進(jìn)行研究。研究應(yīng)該在較高溫度較短時間下進(jìn)行（22）。溫度對熱降解的影響可以通過Arrhenius方程進(jìn)行表示。

其中，k為速率常數(shù)，A為頻率因子，Ea為表觀活化能，R為摩爾氣體常數(shù)（1.987 cal/deg mole），T為熱力學(xué)溫度（25，29，30）。熱降解研究在40℃-80℃條件下進(jìn)行。

8.什么是穩(wěn)定性指示方法？

穩(wěn)定性指示方法（SIM）是用來對制劑中API的降解進(jìn)行定量測定的方法。在FDA指導(dǎo)原則中SIM是一個定量分析方法，可以用來檢測藥物和制劑隨時間變化的穩(wěn)定性情況。SIM在檢測API時，不應(yīng)受到降解產(chǎn)物、雜質(zhì)和輔料的干擾（14）。降解試驗是用來研究SIM方法的專屬性的。開發(fā)一個SIM可以用于處方前研究、穩(wěn)定性研究、貯藏條件開發(fā)。Bakshi和Singh（19）討論了開發(fā)SIM方法的關(guān)鍵問題。Dolan（31）對穩(wěn)定性指示含量方法進(jìn)行了討論并提出了建議。Smela（32）從法規(guī)角度討論了SIM。反相HPLC法廣泛用于雜質(zhì)的分離和定量，通常與UV檢測器聯(lián)用（29）。以下是采用HPLC開發(fā)滿足法規(guī)要求的SIM方法的步驟：

8.1樣品

開發(fā)SIM方法時，API的降解條件應(yīng)比加速試驗劇烈，包括水解、氧化、光照、熱條件。API進(jìn)行固體和液體條件下的降解是為了真實貯藏條件下可能產(chǎn)生的降解雜質(zhì)（33）。

8.2方法開發(fā)與優(yōu)化

在方法開發(fā)前，應(yīng)了解藥物的理化性質(zhì)，如pKa，logP，溶解度，最大吸收，為HPLC方法的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。logP和溶解度有助于選擇流動相和溶劑，而pKa有助于確定流動相的pH值（19）。

分離樣品時首選反相色譜柱，不同比例的甲醇、水、乙腈可以作為初始條件進(jìn)行分離研究。選擇甲醇還是乙腈，應(yīng)基于分析物的溶解度。開始時水-有機相比例可以為50：50，可加入適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)劑來獲得好的分離度。如果想獲得好的分離度與峰對稱性可以加入緩沖液。如果方法用于進(jìn)行LC-MS，流動相緩沖液應(yīng)是MS兼容的，如三氟乙酸或甲酸銨。色譜柱溫度的變化可影響方法選擇的變化，這是因為分析物對溫度變化的反應(yīng)不同。30-40℃的柱溫適合產(chǎn)生好的分離重現(xiàn)性（34）。最好是藥物色譜峰在色譜圖中晚出，這樣可能使所有的降解產(chǎn)物分離，但在藥物色譜峰后也應(yīng)運行足夠長的時間來保證藥物色譜峰后的降解雜質(zhì)能夠充分洗脫出來（19）。

在方法開發(fā)中有時會出現(xiàn)藥物色譜峰中藏著一個雜質(zhì)峰或降解物峰與藥物一起洗脫下來的情況。這時需要峰純度的檢測來確定方法的專屬性。采用PDA檢測器可以在線分析，PDA提供峰光譜是否同質(zhì)的信息，但是不能用于與藥物具有相同UV光譜的降解雜質(zhì)分析。直接方法包括改變色譜條件中的流動相比例、色譜柱等，來改善分離。調(diào)整色譜條件后再進(jìn)行光譜比較。如果降解物峰和藥物峰面積的百分比一樣，可以認(rèn)為藥物峰是同質(zhì)的（35）。與藥物共洗脫出的降解產(chǎn)物如果加速試驗和長期試驗中不產(chǎn)生是可以接受的（1）。方法可以通過調(diào)節(jié)流速、進(jìn)樣體積、色譜柱類型、流動相比例進(jìn)行鄰近色譜峰的優(yōu)化。

8.3方法驗證

開發(fā)的SIM方法應(yīng)根據(jù)USP/ICH指導(dǎo)原則進(jìn)行線性、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、檢測限、耐用性和耐受性的驗證。應(yīng)該能夠分離、識別、定量鑒定限（通常為0.1%）以上的雜質(zhì)（36，37）。如果方法驗證不符合要求，應(yīng)進(jìn)行調(diào)整和重新驗證（35）。

9.其他用來開發(fā)SIM的方法有哪些？

SIM方法的選擇因產(chǎn)品而異，包括很多方法，如電泳、HPLC、peptide mapping（39）等方法。選擇的方法應(yīng)足夠敏感，可以檢出較低水平的雜質(zhì)（如0.05%），且峰響應(yīng)值應(yīng)在檢測器的線性范圍內(nèi)。分析方法應(yīng)檢測出所有在正式穩(wěn)定性試驗中產(chǎn)生的雜質(zhì)（40，41）。LC-MS或LC－NMR法可以用來鑒定降解產(chǎn)物。采用這些方法可以更好的對基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行研究和嚴(yán)格控制（36，39-43）。需要注意的是，在正式的穩(wěn)定性研究中超過鑒定限以上的雜質(zhì)需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證（40）。

有很多新的分析技術(shù)可以用來進(jìn)行SIM方法的開發(fā)（44）。在API和制劑的檢測、藥物開發(fā)、降解試驗、正式穩(wěn)定性研究中，未知雜質(zhì)可以通過各種技術(shù)進(jìn)行分離和分析，如RP-HPLC、TLC、GC、CE、CEC、SFC。HPLC-DAD、LC-MS、LC-NMR、GC-MS可以用來對未分離的降解物進(jìn)行研究。HPLC-DAD、LC-MS可以用來比較相對保留時間、UV光譜、質(zhì)譜（MS/MS或MSN）（29）。Singh和Rehman討論了聯(lián)用技術(shù)在降解物和雜質(zhì)分離方面的應(yīng)用（45）。