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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2018-06-20 12:40
1范圍
細(xì)胞毒性試驗(yàn)是利用細(xì)胞體外培養(yǎng)方法來(lái)評(píng)價(jià)醫(yī)療器械或其浸提液可濾出成分中急性細(xì)胞毒性的潛在性。
2 試驗(yàn)項(xiàng)目選擇（推薦）
根據(jù)GB/T16886.5-1997標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的要求，現(xiàn)推薦下面任何一種細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性，即瓊脂覆蓋法，分子濾過(guò)法，生長(zhǎng)抑制法。
3 試驗(yàn)條件
（1）細(xì)胞株
可以使用已建立的細(xì)胞株，目前我國(guó)使用較多的是L-929（小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞）和V-79（中國(guó)地鼠肺成纖維細(xì)胞）。
（2）培養(yǎng)基
培養(yǎng)基及其血清濃度的含量應(yīng)能適合所選擇細(xì)胞株的生長(zhǎng)，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需要。培養(yǎng)基內(nèi)含抗生素的量應(yīng)不引起細(xì)胞毒性，以免影響材料的評(píng)價(jià)，含血清和谷氨酰胺的培養(yǎng)基在2~8℃貯存不能超過(guò)一周，只含谷氨酰胺不含血清的培養(yǎng)基在2~8℃貯存不能超過(guò)一個(gè)月，培養(yǎng)基的pH值在7.2~7.4之間，所有培養(yǎng)用液都應(yīng)是無(wú)菌的。
（3）樣品的制備
4 試驗(yàn)方法
1)瓊脂覆蓋法
試驗(yàn)樣品：將試驗(yàn)樣品制成100mm2的圓形，要求邊緣光滑整齊。液體材料用0.1mL的樣品吸收在同面積的無(wú)菌濾紙片或纖維素上。
陰性對(duì)照：為已知五毒的材料（反應(yīng)指標(biāo)為0/0）高密度聚乙烯由于有良好的光學(xué)性質(zhì)且易于切割被認(rèn)為最為適宜。制備方法用試驗(yàn)樣品。
陽(yáng)性對(duì)照：為已知的有一定毒性的樣品材料（反應(yīng)指標(biāo)為2/2），含錫的聚氯乙烯是一種較為合適的陽(yáng)性對(duì)照。制備方法同試驗(yàn)樣品。
細(xì)胞株：推薦使用L-929細(xì)胞株。試驗(yàn)用細(xì)胞為傳代（48~72）h生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞。
培養(yǎng)基和試劑：用于細(xì)胞培養(yǎng)液都應(yīng)無(wú)菌。
磷酸鹽緩沖液（PBS-Complete）:
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成分 |
質(zhì)量/g |
|
NaCl |
8.0 |
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KCl |
0.2 |
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Na2HPO4 |
1.15 |
|
KH2PO4 |
2.0 |
|
MgCl2·H2O |
0.5 |
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CaCl2 |
1.0 |
加水至1000mL,過(guò)濾滅菌，4℃貯存。
中性紅濃縮液：
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成分 |
質(zhì)量/g |
|
中性紅 |
2.0 |
加水至2000mL，用磁力攪拌器攪拌1h后，濾紙過(guò)濾，高壓消毒，4℃避光保存。
中性活體染液：
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成分 |
容量/g |
|
中性紅濃縮液 |
1.0 |
|
PBS-Complete |
99.0 |
避光，新鮮配備。
消化液：為0.25%胰酶與0.2%EDTA混合液，其配比為1:9.
培養(yǎng)液：為Eagle’sMEM，內(nèi)含牛血清10%~15%（胎牛血清最好），青霉素、鏈霉素為每毫升培養(yǎng)液100單位。
Eagle’s 瓊脂培養(yǎng)基：
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成分 |
物質(zhì)量 |
|
3%瓊脂 |
一半 |
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Eagle’s培養(yǎng)基 |
一半 |
把加熱熔化的瓊脂和2倍Eagle’s培養(yǎng)基無(wú)菌混合后置50℃水浴中備用。
試驗(yàn)平板：90mm直徑的玻璃培養(yǎng)皿，按組織培養(yǎng)常規(guī)滅菌。
試驗(yàn)步驟（在無(wú)菌條件下進(jìn)行）
制備細(xì)胞懸液：將傳代（48~72）h細(xì)胞經(jīng)消化液作用后，使貼壁細(xì)胞懸浮于營(yíng)養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至3×10^5個(gè)細(xì)胞/mL。
制備平板細(xì)胞單層：每只平板中加入10mL制備好的細(xì)胞懸液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，以使細(xì)胞均勻的分布在培養(yǎng)皿底部。放入含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使其成為融合但不稠密的網(wǎng)狀細(xì)胞單層。
制備瓊脂培養(yǎng)基平板：細(xì)胞原培養(yǎng)液，留下融合好的細(xì)胞懸液，將混合的Eagle’s瓊脂培養(yǎng)沿平皿壁加入平皿內(nèi)，每皿10mL.輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使瓊脂培養(yǎng)基分布均勻，并使其在室溫下凝固。
染色：有兩種方法可供選擇。取10mL新鮮配制的中性紅活體染色，輕輕地置于已凝固的瓊脂表面中央，染液應(yīng)覆蓋整個(gè)表面，避開(kāi)強(qiáng)光，37℃染色15min，傾斜平板并棄去多余染液；將中性紅染液加入熔化的Eagle’s瓊脂培養(yǎng)基（0.1mL中紅加入10mL培養(yǎng)基中），混合后覆蓋于細(xì)胞單層上。
放置試驗(yàn)樣品：應(yīng)立即放置樣品，最遲不超過(guò)染色后1h。
將樣品對(duì)稱地放在瓊脂表面，可輕輕加壓以瓊脂表面接觸，但不可破壞瓊脂表面，在放置樣品30min內(nèi)將培養(yǎng)放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
試樣位置：一只陰性樣品，一只陽(yáng)性樣品和良知相同的試樣對(duì)稱地放置在培養(yǎng)皿的瓊脂表面，試樣邊緣距培養(yǎng)皿的邊緣15mm，每一種試驗(yàn)樣品至少做兩只培養(yǎng)皿。
結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)
在白色背景下，觀察樣品周圍及樣品下面脫色區(qū)范圍。在陰性樣品周圍和下面的細(xì)胞單層應(yīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)，即R=0/0，陽(yáng)性樣品亦應(yīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，即R=2/2，否則該培養(yǎng)皿棄之。
反應(yīng)指標(biāo)：反應(yīng)情況用反應(yīng)指標(biāo)“R”來(lái)表示，即
R=Z/L
式中，Z為區(qū)域指標(biāo)（如表1-4-1所示），與脫色區(qū)大小有關(guān)；L為細(xì)胞溶解指標(biāo)（如表1-4-2所示），與區(qū)域細(xì)胞溶解的范圍有關(guān)。
表1-4-1 區(qū)域指標(biāo)
|
區(qū)域指標(biāo) |
區(qū)域內(nèi)情況 |
|
0 |
樣品下和周圍無(wú)可觀察到的脫色區(qū) |
|
1 |
脫色區(qū)局限樣品下 |
|
2 |
從樣品邊緣擴(kuò)散脫色區(qū)≤5mm |
|
3 |
從樣品邊緣擴(kuò)散脫色區(qū)≤10mm |
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4 |
從樣品邊緣擴(kuò)散脫色區(qū)＞10mm，但未布滿整個(gè)培養(yǎng)皿 |
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5 |
脫色區(qū)布滿整個(gè)培養(yǎng)皿 |
表1-4-2 溶解指標(biāo)
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溶解指標(biāo) |
脫色區(qū)域內(nèi)情況 |
|
0 |
未觀察到細(xì)胞溶解現(xiàn)象 |
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1 |
脫色區(qū)內(nèi)細(xì)胞溶解達(dá)20%以內(nèi) |
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2 |
脫色區(qū)內(nèi)細(xì)胞溶解在20%~40%之間 |
|
3 |
脫色區(qū)內(nèi)細(xì)胞溶解在40%~60%之間 |
|
4 |
脫色區(qū)內(nèi)細(xì)胞溶解在60%~80%之間 |
|
5 |
脫色區(qū)內(nèi)細(xì)胞溶解在80%以上 |
反應(yīng)指標(biāo)應(yīng)作為2個(gè)數(shù)來(lái)報(bào)告（不是一個(gè)分?jǐn)?shù)），兩個(gè)指標(biāo)的大小都應(yīng)很明顯，對(duì)每一只樣品應(yīng)報(bào)告其區(qū)域指標(biāo)的指標(biāo)平均值和溶解指標(biāo)的平均值。無(wú)論何種原因，一個(gè)指標(biāo)的四個(gè)值丟失了一個(gè)以上，則該試驗(yàn)棄之，如僅丟失了一個(gè)，則其他三個(gè)的平均值可作為指標(biāo)來(lái)報(bào)告。
在同一試驗(yàn)中，4個(gè)相同的樣品指標(biāo)大小有2個(gè)或2個(gè)單位以上的差異。如果數(shù)值在0~3以內(nèi)，則應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)；如數(shù)值是4~5，表示有高度彌散的毒性物質(zhì)，則不必重復(fù)試驗(yàn)。
為了試驗(yàn)的可靠起見(jiàn)，規(guī)定每種樣品重復(fù)試驗(yàn)一次以上，最后報(bào)告其指標(biāo)的平均值。
試驗(yàn)報(bào)告
包括試驗(yàn)材料和陰、陽(yáng)對(duì)照材料的化學(xué)名稱、商品名稱、產(chǎn)品批號(hào)、生產(chǎn)廠家以及材料試驗(yàn)尺寸規(guī)格與消毒方式。
指出試驗(yàn)用細(xì)胞名稱、來(lái)源、培養(yǎng)基種類。
描述操作步驟：包括制備細(xì)胞懸液、制備細(xì)胞單層、覆蓋瓊脂、染色等。
顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。
對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行評(píng)價(jià)
2）分子濾過(guò)法
目的：本試驗(yàn)用于試驗(yàn)材料的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。
試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備。
試驗(yàn)樣品
按照生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品說(shuō)明準(zhǔn)備試驗(yàn)樣品，將試驗(yàn)樣品制備成直徑7mm的圓形膜片，要求有一個(gè)平面，使其可以充分地與濾膜接觸，試驗(yàn)樣品的質(zhì)量不應(yīng)超過(guò)3g，亦可用直徑為7mm的纖維素片汲取0.1mL浸提液放置在分子濾膜片上。
空白對(duì)照樣品：只長(zhǎng)在單層細(xì)胞的分子濾膜或單純的分子濾膜。
陽(yáng)性對(duì)照樣品：推薦使用稀釋的苯酚溶液作為陽(yáng)性對(duì)照樣品。
細(xì)胞株、培養(yǎng)基
細(xì)胞株：人上皮細(xì)胞株（HeLa）、小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞株（L-929）。
培養(yǎng)基：用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)用液都應(yīng)是無(wú)菌的。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基：采用Eagle’s培養(yǎng)基，加10%胎牛血清，1×10^5IU/L青霉素，100mg/L鏈霉素及10mmol鏈霉素和10mmol/L HEPES緩沖液。
試驗(yàn)步驟
消化收集細(xì)胞并用生長(zhǎng)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.5×10^5/mL,在直徑為50mm組織培養(yǎng)皿中放置的直徑47mm、孔徑0.45μm的分子濾膜加上6mL細(xì)胞懸液，在5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
加5mL約40℃的瓊脂培養(yǎng)基于一空白的組織培養(yǎng)皿內(nèi)，使其室溫下凝固。將用37℃磷酸緩沖液漂洗后的附有單層細(xì)胞的分子濾膜，細(xì)胞面向下放置在瓊脂培養(yǎng)基面，每一濾膜上放置3~5個(gè)樣品，每種材料測(cè)10個(gè)樣品，空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照操作方法相同。放置樣品后，在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h。
培養(yǎng)后移去試驗(yàn)樣品并輕輕地從瓊脂培養(yǎng)基上拿下分子濾膜，用細(xì)胞化學(xué)方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞單層的琥珀酸脫氫酶的活性。37℃孵育3h后，用蒸餾水洗滌。風(fēng)干。
結(jié)果評(píng)價(jià)
在顯微鏡下檢查濾膜，含細(xì)胞單層的膜片染為深藍(lán)色，沒(méi)有細(xì)胞的濾膜用來(lái)觀察試驗(yàn)材料可能對(duì)濾膜產(chǎn)生的影響。按照表1-4-3判斷試驗(yàn)樣品的細(xì)胞毒性。
按照記分系統(tǒng)，對(duì)材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行分級(jí)、報(bào)告。
3）細(xì)胞生長(zhǎng)抑制法[MTT（四咪唑）比色法]
（1）細(xì)胞株：L-929（小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞）。
|
評(píng)分 |
評(píng)價(jià) |
解釋 |
|
0 |
與單層細(xì)胞的其他部分比較染色無(wú)差異 |
無(wú)細(xì)胞毒性 |
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1 |
存在染色淺或未染色區(qū)，其直徑小于試樣（7mm） |
輕度細(xì)胞毒性 |
|
2 |
未染色區(qū)域?yàn)椋?~11）mm |
中度細(xì)胞毒性 |
|
3 |
未染色區(qū)域?yàn)?2mm以上 |
明顯細(xì)胞毒性 |
（2）儀器：免疫酶標(biāo)儀。
（3）培養(yǎng)液和試劑
培養(yǎng)液：詳見(jiàn)瓊脂覆蓋法。
消化液：詳見(jiàn)瓊脂覆蓋法。
PBS緩沖液：詳見(jiàn)瓊脂覆蓋法。
MTT（四咪唑）：濃度為5mg/mL溶于PBS中。
（4）樣品制備：將無(wú)菌的樣品浸在培養(yǎng)液中（含10%胎牛血清）靜置24h，浸提液量與樣品表面積之比為10mL/cm2,浸提液制備好后，將其一般用培養(yǎng)液稀釋成溶度為50%.
（5）培養(yǎng)（1~2）d的L-929細(xì)胞，吸收原培養(yǎng)液，加入消化液，消化，吸收消化液，加入新配置的培養(yǎng)液，使細(xì)胞成懸浮液計(jì)數(shù)，稀釋成1×10^4個(gè)細(xì)胞/mL。接種于3塊96孔塑料板上，每組4孔，每孔100μL。在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁，24h后，加樣品，將每孔中原培養(yǎng)液吸除?？瞻讓?duì)照加新配置的培養(yǎng)液100μL，試驗(yàn)組分分別加100%和50%樣品浸提液，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在2d、4d、7d時(shí)，分別各取出一塊培養(yǎng)板，吸除樣品浸提液加入20μL/孔MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后吸除，再加入150μL/孔二甲基亞砜，振蕩10min，在免疫酶標(biāo)儀上以500nm波長(zhǎng)測(cè)吸收值，通過(guò)下式計(jì)算相對(duì)增殖率（RGR）：
（6）結(jié)果評(píng)價(jià)：根據(jù)RGR均值，岸標(biāo)1-4-4所列評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品細(xì)胞毒性程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。
表1-4-4 細(xì)胞相對(duì)增殖率評(píng)價(jià)
|
評(píng)分 |
細(xì)胞相對(duì)增殖率 |
|
0級(jí) |
≥100 |
|
1級(jí) |
75~99 |
|
2級(jí) |
50~74 |
|
3級(jí) |
25~49 |
|
4級(jí) |
1~25 |
|
5級(jí) |
0 |
參考：徐秀林. 無(wú)源醫(yī)療器械檢測(cè)技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2007：17-22.
來(lái)源：AnyTesting
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