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一、用途：

            藥物篩選、

            細(xì)胞增殖測(cè)定、

            細(xì)胞毒性測(cè)定、

            腫瘤藥敏試驗(yàn)等。

 

二、優(yōu)點(diǎn)：

· 使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；

 

· CCK-8法能快速檢測(cè)；

 

· CCK-8法的檢測(cè)靈敏度很高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；

 

· CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法，MTT 實(shí)驗(yàn)生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；

 

· 而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；

 

· CCK-8法對(duì)細(xì)胞毒性小，可以多次測(cè)定選取最佳測(cè)定時(shí)間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

 

· CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。

 

三、所需設(shè)備及儀器：

1. 10ul，100-200ul及多通道移液器

2. 酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）

3. 96孔培養(yǎng)板

4. 二氧化碳培養(yǎng)箱

四、方法及步驟：

 

實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×10⁴），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。

 

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配），以換液的形式加入。

5、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件（建議預(yù)實(shí)驗(yàn)先摸清楚時(shí)間點(diǎn)）。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

 

6、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞毒性分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約≥5×10⁴），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。

 

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

 

4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)。

 

5、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定，起碼要一代以上的時(shí)間（例如：6、12、24、48、60、72小時(shí)）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

7、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

 

8、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長450-490nm，參比波長600-650nm。

 

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

 

· 若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

 

· 如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

 

· 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。

 

· 酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

 

· CCK8可以檢測(cè)大腸桿菌，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測(cè)定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。

 

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。

 

· 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測(cè)定孔用。

 

· 在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

 

· 金屬對(duì)CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話，將會(huì)100%抑制。

 

· 懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。

 

· 加入CCK-8 時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

 

·  用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定，且要擦拭干凈樣品板了。