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一、基本原理：

免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。 

 

二、應(yīng)用范圍：

其應(yīng)用范圍極其廣泛，可以測定內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、腫瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢測、免疫學(xué)、血型鑒定等。

 

三、基本實(shí)驗(yàn)步驟：

1、細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

2、固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.

3、通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

4、封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.

5、一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

6、二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

7、封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

 

四、注意事項(xiàng)：

1、染完之后沒有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時(shí)間，熒光會崔滅的。

2、熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。

3、二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看?！?/span>

4、整個操作在4℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

5、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性?！?/span>

6、加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色?！?/span>

7、細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色?？勾銣鐒┛赡脕碇苯臃馄?20微升即可，之后片子可保留更長時(shí)間。

 

五、熒光物質(zhì)：

1、熒光色素

　　許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：

　　(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490--495nm，最大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

　　(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。

　　(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）

最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

2、其他熒光物質(zhì)

　?。?）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。

　?。?）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3

　　螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。

 

六、常見熒光素的特性：

1、FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

2、RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595~600nm，橘紅色熒光。

3、TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。

4、鑭系：Eu、Tb

5、PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。

6、其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)