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什么是蛋白質(zhì)印記法？

蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

蛋白質(zhì)印跡法是由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡（Western Blot）是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。

 

蛋白質(zhì)印記法的原理

Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

 

蛋白質(zhì)印記法顯色的方法分類

Western Blot顯色的方法主要有以下幾種：

i. 放射自顯影

ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL

iii. 底物熒光ECF

iv. 底物DAB呈色

現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

 

操作步驟

試劑準(zhǔn)備

1、SDS-PAGE試劑：見電泳實驗。

2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O 2.8ml。

3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202 1.0μl。

 

樣品制備

1、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/span>

（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

（2）每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）

（4）每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。

（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中（整個操作盡量在冰上進(jìn)行）。

（6）于4℃下12000rpm離心5min（提前開離心機(jī)預(yù)冷）。

（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中放于－20℃保存。

 

2、組織中總蛋白的提?。?/span>

（1）將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。

（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

（4）裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。

 

3、加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/span>

（1）將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。

（2）棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。

 

含量測定

 

1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1 ）從－20℃取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。

（2）取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標(biāo)記為0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。

（3 ）在各管中加入各種試劑。

（4）混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。

 

2、檢測樣品蛋白含量

（1）取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。

（2 ）取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/L NaCl溶液100ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。

（3 ）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5mL），再用無菌水洗一次。

（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。

注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結(jié)果是5ml樣品含的蛋白量。

 

SDS－PAGE電泳

 

1、清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

 

2、灌膠與上樣

（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠）。

（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）

（3 ）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

（4 ）按前面方法配4%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

（5 ）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）

（6）測完蛋白含量后，計算含50ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×（上樣總體積一般不超過15μl，加樣孔的最大限度可加20μl樣品）。上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。

（7）加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板）。用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

 

3、電泳

電泳時間一般4～5h，電壓為40V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

1、轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3cm的濾紙和1張7.3～8.6cm的NC膜或PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的NC膜或PVDF膜置于水上浸2h才可使用。用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

2、將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動）。在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。

3、要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）。

4、將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰，或?qū)⑥D(zhuǎn)移槽埋于冰水混合物中來降溫。一般用80V轉(zhuǎn)移1h，或60V轉(zhuǎn)移2h，或40V轉(zhuǎn)移3h。

5、轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。

 

免疫反應(yīng)

1、將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。

2、將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

3、同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，重復(fù)步驟（2）中最后一步，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

 

化學(xué)發(fā)光

1、將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。

2、在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2min（20～25℃），溫度過低時（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響。

 

凝膠圖象分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。 [3]

 

其他

值得一提的是，western blot這個名稱的由來很有意思。最開始做印跡工作的是一個叫做Edwin Southern的科學(xué)家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術(shù)稱為Southern blot，后來類似的出現(xiàn)了兩個過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個針對RNA，一個針對蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)稱為northern blot（由斯坦福大學(xué)的George Stark發(fā)明）和Western blot，這兩個技術(shù)的命名與發(fā)明人的名字沒有關(guān)系了。