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常見熒光定量PCR方法比較

SYBR Green I 檢測模式

SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結合后， 熒光大大增強。因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關，可以根據(jù)熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。PCR 擴增程序一般為 94℃～55℃～72℃三步法，40 個循環(huán)。SYBR Green I 的缺點：由于 SYBR Green I 沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結合發(fā)光，對 PCR 反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。

SYBR Green I 的優(yōu)點：SYBR Green I 的優(yōu)點是因為其缺點產生，由于它能所有的雙鏈DNA相結合，所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，因此國內外在科研中使用比較普遍。

SYBR GREEN I work principle

水解探針模式(Taqman探針)

TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的 5’末端， 而淬滅劑則在 3’末端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與 3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的 5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此 Taqman 探針檢測的是積累熒光。PCR 擴增程序通常是：94℃～60 ℃ 40 個循環(huán)。常用的熒光基團是 FAM，TET，VIC，HEX。

Taqman work principle

雜交探針模式(Beacon、FRET)

分子信標是一種呈發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發(fā)后產生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標的莖環(huán)結構中，環(huán)一般為 15-30 個核苷酸長，并與目標序列互補;莖一般 5-7 個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團標記在探針的一端，而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下，因為模板不存在時形成莖環(huán)結構，當加熱變性會互補配對的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在，分子信標也是積累熒光。常用的熒光基團：FAM ，Texas Red 。PCR 擴增程序通常是：94～55～72 ℃三步法，40 個循環(huán)。

分子信標工作原理

FRET 探針又稱雙雜交探針，F(xiàn)RET 探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的 5`端標記 FAM 熒光基團，另一探針的 3`端標記 Red 640 熒光基團。當復性時，探針結合在模板上，F(xiàn)AM 基團和 Red640 基團相鄰，激發(fā) FAM 產生的熒光，作為 Red640 基團的激發(fā)光被吸收，使 Red640發(fā)出波長為 640 的熒光。當變性時，探針游離，兩基團距離遠，不能產生 640 波長的熒光。由于 FRET 探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實時信號，非累積信號。常用的熒光基團是：LC-Red640，LC-Red705。

能用于實時熒光 PCR 定量的方法很多，各有優(yōu)缺點，應根據(jù)實驗的需要和當前的實驗條件選擇適合自己的方法。下面為各種方法的比較：