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色譜工作者常會碰到這樣的問題，什么時候該換色譜柱了?

塔板數(shù)是一個粗略的指標(biāo)，不能作為評價色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)。

通常使用塔板數(shù)來考察色譜系統(tǒng)：將新柱子接到儀器上，根據(jù)色譜柱生產(chǎn)商提供的測試條件測試該色譜柱，你應(yīng)該得到和分析報告上同樣的結(jié)果。最差也應(yīng)該得到比報告值低10%的塔板數(shù)。如果你所測得的塔板數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于廠家提供的報告數(shù)據(jù)，這就說明你的色譜系統(tǒng)可能存在一些問題。進(jìn)樣器、柱外效應(yīng)、毛細(xì)連接以及檢測器都是容易出現(xiàn)問題的地方。
 

相信每個色譜工作者都會關(guān)心分辨率，分辨率是考察一根色譜柱分離具體樣品的好壞程度的指標(biāo)。色譜的核心任務(wù)就是為了使每個峰完成分離，我們在實際工作中需要得到合理峰寬的窄峰以便獲得較低的檢測限(這已經(jīng)不是什么難題，現(xiàn)在的色譜柱都可以達(dá)到這個要求)。
 

然而，我們需要考慮的另一個因素是塔板數(shù)對分辨率的影響僅僅是平方根的關(guān)系，這意味著當(dāng)一根色譜柱的塔板數(shù)下降50%，分辨率僅僅下降7%。而當(dāng)一根色譜柱塔板數(shù)下降為新柱子一半的時候，你肯定看到了其它更加嚴(yán)重的癥狀告訴你這根色譜柱的壽命不長了。其實，大多數(shù)用戶僅僅使用色譜柱塔板數(shù)的一小部分。例如，對一支新的150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱來講，廠家測試報告上的塔板數(shù)為14,000。使用下面的公式可以估算一支色譜柱的塔板數(shù)：
 

N=3000*L/Dp
 

L是色譜柱的柱長，以厘米為單位;Dp是填料的粒徑，以微米為單位
 

一支150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱的柱效大約為9000，比廠家測試數(shù)據(jù)低30%。在實際的工作中，大多數(shù)色譜方法僅僅需要這些塔板數(shù)的一半，這些色譜方法還有優(yōu)化的空間嗎?答案是肯定的。可見，色譜柱的塔板數(shù)不是分離中最重要的參數(shù)。
 

較好的方法是使用壓力、分辨率和峰形的混合指標(biāo)來考察一根色譜柱的狀態(tài)。壓力的測量是最容易的，通常我們確定的色譜方法要滿足以下的要求：用新柱子時柱壓不高于2500psi，在任何情況下壓力都不超過3000psi。盡管現(xiàn)代的液相色譜系統(tǒng)都可在更高的壓力下使用，但由于高壓產(chǎn)生的系統(tǒng)損耗和泄漏的問題會很嚴(yán)重。當(dāng)壓力超過3000psi時，考慮更換進(jìn)樣器和色譜柱之間的0.5mm孔徑的在線濾片。如果更換濾片后壓力仍然高，則色譜柱的濾片或者是色譜柱已經(jīng)被污染，這提示我們該換柱子了。有統(tǒng)計表明，超過60%的色譜柱損壞是由于壓力過高的原因。
 

分辨率是我們考察色譜柱的一個非常重要的指標(biāo)，只要兩個組分可以獲得基線分離，對該分析物的定量就不會有什么問題。對于對稱的高斯峰來講，1.5的分辨率即可得到基線分離;若Rs在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴(yán)重則需要更高的分辨率。使用分辨率作為色譜柱的評價指標(biāo)的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。
 

另外一個考察色譜柱質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是峰形拖尾情況，廠家測試報告的峰形都非常漂亮，但這并不代表該色譜柱分析實際樣品的情況。實際樣品中總是含有或多或少引起峰形拖尾的組分。最值得一提的是含有氮原子的化合物，這些化合物和硅膠骨架上的游離硅羥基結(jié)合非常緊密，隨著色譜柱使用時間越長，鍵合相流失，拖尾則更加嚴(yán)重。然而拖尾情況的改變不像分辨率的改變那樣能夠馬上看出來?；诖?，最好定一個拖尾因子的上限，如美國藥典規(guī)定拖尾因子不超過1.8。
 

確定色譜柱“拋棄”標(biāo)準(zhǔn)的最佳時間是當(dāng)我們開發(fā)分析方法或作方法認(rèn)證的時候。通常，在開發(fā)分析方法的過程中你會試驗幾根色譜柱，分析足夠多的實際樣品，你知道當(dāng)分離變差的時候是什么樣的情況。我傾向于在開始時使用一個寬的范圍。我們的經(jīng)驗是這樣的：你如果在開始時緊縮系統(tǒng)適用性要求，在方法認(rèn)證后再放寬這個要求是很困難的。在分析實際樣品之前進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察，以確保該色譜方法滿足分析者可以接受的標(biāo)準(zhǔn)。

色譜柱使用前的注意事項

色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。

但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。

樣品的前處理

a、最好使用流動相溶解樣品。

b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

流動相的配制

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。

c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進(jìn)行。

f、在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

流動相流速的選擇

因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當(dāng)選用最佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆?qiáng)度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

1．由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。

2．對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。

3．含水流動相最*在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。

4．流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

5．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。