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0 引 言

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)是一種以次黃嘌呤核苷酸為底物，經(jīng)生物發(fā)酵技術(shù)制得的一種高能化合物，是生物體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動(dòng)所需能量的直接來(lái)源，被譽(yù)為細(xì)胞內(nèi)能量的“分子通貨”，能夠儲(chǔ)存和傳遞化學(xué)能，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核酸的代謝[1-2].ATP作為最重要的能量分子在細(xì)胞的各種生理、病理過(guò)程中起著重要作用，可以作為細(xì)胞活性的一個(gè)重要標(biāo)志物.ATP也常作為檢測(cè)微生物污染的一個(gè)指標(biāo)[3-4]，通過(guò)檢測(cè)ATP含量，可以檢測(cè)食品、水、藥品、化妝品等的微生物污染情況，通過(guò)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞線粒體內(nèi)ATP含量的變化，可以預(yù)測(cè)各種藥物、生物制劑或生物活性物質(zhì)引起的細(xì)胞殺傷、細(xì)胞抑制和細(xì)胞增殖作用.

目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)檢測(cè)ATP的方法主要有紙層析法[5-6]，電化學(xué)傳感器法[7-8]，離子交換色譜[9]，高效液相色譜[10-11]，分光光度法[12-15]，生物發(fā)光法[16-17]和基于核酸適體的方法[18-21]等.這些方法中有的操作比較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，制備過(guò)程復(fù)雜，如紙層析法和電化學(xué)傳感器法；有的對(duì)儀器設(shè)備要求高，且需要特定的酶，如高效液相色譜法和生物發(fā)光法；有的精度低，如離子交換色譜法.因此，探索新的、靈敏度高的、快速便捷的檢測(cè)方法對(duì)于檢測(cè)ATP在食品、藥品、環(huán)境水樣中的微生物污染情況等具有十分重要的意義.

二級(jí)散射(second-order scattering,SOS)作為一種新發(fā)展起來(lái)的分析技術(shù)，因其靈敏度高，簡(jiǎn)單便捷的優(yōu)點(diǎn)引起人們的關(guān)注[22-23]，并在金屬離子[24]、表面活性劑[25]、蛋白質(zhì)[26]、核酸[27]、藥物[28]及環(huán)境樣品[29]的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用.本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，在中性條件下，雙核鈾酰配合物(binuclear uranyl-isophthalaldehyde-tetrapyrrole,BUIPTP)與ATP能形成一種配合物體系，對(duì)體系進(jìn)行光譜性能測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在體系激發(fā)波長(zhǎng)的二倍處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)峰，激發(fā)波長(zhǎng)位于566 nm處，在最大激發(fā)波長(zhǎng)處，體系的SOS強(qiáng)度隨著ATP的濃度的增加存在這線性關(guān)系，可用于痕量分析，且該方法具有較高的靈敏度，檢出限為0.75 nmol/L，其靈敏度較常見(jiàn)的檢測(cè)ATP的方法要大大的提高.研究雙核鈾酰配合物(BUIPTP)與ATP的配位反應(yīng)對(duì)二級(jí)散射強(qiáng)度的影響，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行一系列的優(yōu)化，得出的結(jié)果讓人滿意.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

儀器：UV-3900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立)，IR Prestige-21傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)，Hitachi-F7000熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，IKA-MAGHS7恒溫加熱磁力攪拌器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)，DZF-6020真空干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，pHs-10C數(shù)字酸度計(jì)(上海雷磁科學(xué)儀器廠)，電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司).

試劑：IPTP是實(shí)驗(yàn)室自制，六水合硝酸鈾酰是購(gòu)買(mǎi)于湖北楚盛威化工有限公司，三磷酸腺苷(ATP)購(gòu)買(mǎi)于上海Aladdin化學(xué)試劑有限公司.

1.2 制備雙核鈾酰配合物

利用鈾酰與雙極雙齒配體(isophthala ldehyde-tetrapyrrole,IPTP)反應(yīng)合成了雙核鈾酰配合物(見(jiàn)圖1).合成步驟如下：IPTP參照文獻(xiàn)[30] 的方法合成；將IPTP(0.366 0 g，1.0 mmol)和六水合硝酸鈾酰(0.502 0 g，1.0 mmol)溶解在100 mL體積比為3∶1的無(wú)水乙醇與水溶液中，將混合物室溫下用磁子攪拌10 h使其發(fā)生螯合反應(yīng).將溶劑減壓除去，得到的固體用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，然后用柱層析進(jìn)行提純，所得產(chǎn)物即為純的BUIPTP.

1.3 BUIPTP溶液的配制

用分析天平準(zhǔn)確稱量BUIPTP固體0.740 0 g，經(jīng)二次蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，加水定容至刻度線，搖勻，即得10 μmol/L的BUIPTP溶液.

1.4 ATP的測(cè)定步驟

在10 mL比色管中加入500 μL的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液與200 μL 的Tris-Hcl緩沖液(pH 7).在攪拌下將100 μL 10 μmol/L 的BUIPTP溶液滴加到上述溶液中，總滴加時(shí)間為10 min，將該溶液孵育30 min.在激發(fā)波長(zhǎng)283 nm，發(fā)射波長(zhǎng)566 nm處用熒光分光光度計(jì)測(cè)定該體系的二級(jí)散射光譜.在566 nm波長(zhǎng)處繪制二級(jí)散射光強(qiáng)度對(duì)ATP濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行腺苷和其它三種磷酸核苷酸的平行實(shí)驗(yàn).ATP與BUIPTP反應(yīng)以及檢測(cè)ATP的過(guò)程示意圖見(jiàn)圖1.

圖1 ATP與BUIPTP反應(yīng)和檢測(cè)ATP的過(guò)程示意圖
Fig.1 The reaction of ATP with BUIPTP and the illustrated procedure of ATP detection

2 結(jié)果與討論

2.1 二級(jí)散射光譜特征

圖2為BUIPTP與不同濃度的ATP溶液的二級(jí)散射光譜圖.當(dāng)體系中不存在ATP時(shí)，溶液的二級(jí)散射強(qiáng)度較弱.當(dāng)加入ATP溶液后，體系的二級(jí)散射強(qiáng)度增強(qiáng).因?yàn)锳TP與BUIPTP形成大的空間體積，使得二級(jí)散射強(qiáng)度增強(qiáng).在最佳條件下，BUIPTP-ATP體系二級(jí)散射增加的強(qiáng)度與一定范圍的ATP濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系.因此，可以利用由ATP和BUIPTP引起的反應(yīng)來(lái)建立二級(jí)散射光譜法檢測(cè)ATP.選定在566 nm處檢測(cè)ATP的二級(jí)散射光強(qiáng)度.

2.2 酸度的影響

我們首先研究了溶液的酸度對(duì)體系二級(jí)散射強(qiáng)度的影響.由圖3可看出，隨著pH值增大，二級(jí)散射強(qiáng)度出現(xiàn)先增強(qiáng)而后降低現(xiàn)象.pH為7時(shí)，體系的二級(jí)散射強(qiáng)度最大.結(jié)果顯示，在中性介質(zhì)中該反應(yīng)的效果是最好的.究其原因可能是在強(qiáng)酸性介質(zhì)中ATP的氨基質(zhì)子化，導(dǎo)致ATP與BUIPTP結(jié)合的親和力減弱.當(dāng)pH值高于7.0時(shí)，溶液中的氫氧根離子會(huì)與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合BUIPTP.因此，采用pH 7的Tris-HCl緩沖溶液.

ATP的濃度為：a-g:0,50,100,200,300,400,500 nmol/L
圖2 溶液的二級(jí)散射光譜圖
Fig.2 The second-order scattering of ATP and BUIPTP system

2.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定了體系在 0～50 min內(nèi)，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系二級(jí)散射強(qiáng)度的影響，結(jié)果顯示：反應(yīng)在達(dá)到30 min后二級(jí)散射強(qiáng)度即達(dá)到最大，并在30～50 min內(nèi)幾乎保持不變(如圖4).本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)30 min后測(cè)定.

圖3 pH對(duì)二級(jí)散射強(qiáng)度的影響
Fig.3 Effect of pH on the second-order scattering

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)二級(jí)散射強(qiáng)度的影響
Fig.4 Effect of reaction time on the second-
order scattering

2.4 ATP和BUIPTP加入順序的影響

測(cè)試了ATP和BUIPTP加入順序的影響.結(jié)果表明，將BUIPTP滴加到ATP溶液時(shí)的二級(jí)散射信號(hào)比ATP滴加到BUIPTP溶液時(shí)的更強(qiáng).可能是因?yàn)锽UIPTP滴加到ATP溶液中時(shí)，BUIPTP與ATP的反應(yīng)物質(zhì)的量之比為1∶2.但是將ATP滴加到BUIPTP溶液時(shí)，BUIPTP與ATP以物質(zhì)的量之比為1∶2和1∶1同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，這使得二級(jí)散射信號(hào)稍微較弱.所以本研究選擇將BUIPTP滴加到ATP溶液.

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度ATP的二級(jí)散射強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)定，并作出了校正曲線.如圖5，該標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，ATP濃度在2.5～500 nmol/L范圍內(nèi)，二級(jí)散射強(qiáng)度(ISOS)與ATP濃度(c)之間具有良好的線性關(guān)系.線性回歸方程為：ΔISOS=548+7.98c (nmol/L)，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 1.平行測(cè)定11份空白溶液，根據(jù)檢出限公式FLOD=3Sb/m(Sb為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，m為工作曲線的斜率)，檢出限為0.75 nmol/L.分別對(duì)ATP濃度為100 nmol/L和300 nmol/L兩組待測(cè)液進(jìn)行六次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.56%和2.03%.

圖5 測(cè)定ATP的校準(zhǔn)曲線
Fig.5 Calibration curve for the determination of ATP

2.6 選擇性試驗(yàn)

為了研究實(shí)驗(yàn)的選擇性，我們使用單獨(dú)的三磷酸腺苷(ATP)和單獨(dú)的磷酸根進(jìn)行比較(見(jiàn)圖6).

圖6 含有相同的濃度的ATP、磷酸根、ATP和
磷酸根共存的BUIPTP溶液的
標(biāo)準(zhǔn)化二級(jí)散射強(qiáng)度
Fig.6 Normalized second-order scattering intensity of BUIPTP solution containing the same concentration of ATP, phosphate, and ATP and phosphate coexistence

結(jié)果表明，當(dāng)濃度相同時(shí)，單獨(dú)存在ATP時(shí)的IRLS值比單獨(dú)的磷酸根存在時(shí)的IRLS值高，并且當(dāng)ATP與磷酸根共存時(shí)與單獨(dú)存在ATP時(shí)的IRLS值大致相同.說(shuō)明該方法對(duì)ATP具有很好的選擇性，進(jìn)一步證明BUIPTP中的鈾酰能特異性地結(jié)合ATP中的磷酸基團(tuán)和腺苷.

2.7 共存物質(zhì)的影響

在選定條件下，我們對(duì)體系進(jìn)行了共存物質(zhì)影響的干擾情況研究.結(jié)果見(jiàn)表1，表中所列的相對(duì)誤差在±5%的范圍內(nèi)，基本對(duì)ATP的測(cè)定無(wú)干擾.

表1 共存物質(zhì)的影響
Table 1 The impact of coexisting substances

2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

使用該法對(duì)實(shí)際注射藥劑樣品中的ATP和藥片中的ATP含量進(jìn)行了測(cè)定.使用二次蒸餾水稀釋ATP注射液到合適的濃度.將ATP藥片研磨成粉末，用分析天平精確稱取一定量的粉末后用二次蒸餾水稀釋至所需濃度.按照以上實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)稀釋后的樣品中的ATP進(jìn)行測(cè)定.為了評(píng)估該方法的實(shí)用性和可靠性，本研究進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)濃度的ATP回收實(shí)驗(yàn).由表2可知，樣品平行測(cè)定的RSD都低于2.5%，回收率在99.0%～101.0%范圍內(nèi)(n=6).結(jié)果表明，該研究方法可以成功應(yīng)用于實(shí)際樣品中ATP的檢測(cè)，并且具有較好的回收率.

表2 實(shí)際樣品分析(n=6)
Table 2 Analysis of real samples(n=6)

3 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)研究中，建立了一種新的二級(jí)散射法不經(jīng)分離直接檢測(cè)ATP.該方法是基于ATP和BUIPTP反應(yīng)生成的配合物而引起二級(jí)散射增強(qiáng)這一原理建立的.該分析方法具有簡(jiǎn)單方便、靈敏度高、親和力高、對(duì)ATP的特異性以及不經(jīng)過(guò)分離操作過(guò)程等優(yōu)點(diǎn).該方法可為其他類似目標(biāo)分析物如CTP、GTP等的檢測(cè)提供一種新的思路，并且在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境學(xué)等領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值.