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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2018-10-11 09:22
分光光度法
分光光度法是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度,對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。其應(yīng)用光區(qū)包括紫外光區(qū)(200~400nm)、可見光區(qū)(400-760nm)、紅外光區(qū)(760~10000nm)[1]。常用紫外光區(qū)和可見光區(qū)進(jìn)行物質(zhì)的測(cè)定,用紫外光源測(cè)定無色物質(zhì)的方法,稱為紫外分光光度法;用可見光光源測(cè)定有色物質(zhì)的方法,稱為可見光光度法[2]。
自1852年利用硫氰酸鉀測(cè)定鐵以來,這種利用分子吸收特性測(cè)定物質(zhì)含量的方法至今已有百多年歷史了,它具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn),該法一直承擔(dān)著微量組份分析的主要任務(wù)[3]。
定量分析
原理:朗伯-比爾(Lambert - Beer)定律。
當(dāng)一束單色光通過一均勻溶液時(shí),溶液對(duì)單色光的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。即A=abc,其中吸光系數(shù)a,表征吸光物質(zhì)的靈敏度,a值越大,靈敏度越高;b為溶液的液層厚度(光程);c為溶液的濃度。當(dāng)液層厚度b和吸光系數(shù)a固定時(shí),吸光度A與溶液的濃度成線性關(guān)系。在定量分析時(shí),首先需要測(cè)定溶液對(duì)不同波長光的吸收情況(吸收光譜),從中確定最大吸收波長 ,然后以此波長 的光為光源(單色光),進(jìn)行吸光度A的測(cè)定,這是朗伯比爾定律用于定量分析的首要條件。
方法:標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法等
標(biāo)準(zhǔn)曲線法:配制一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,選用適宜的參比,在相同條件下,測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,做A-c曲線,即標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可用最小二乘數(shù)處理,得線性回歸方程。在相同條件下測(cè)定未知試樣的吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以找到與之對(duì)應(yīng)的未知試樣的濃度。
標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法:將待測(cè)溶液與某一標(biāo)樣溶液,在相同條件下測(cè)定各自的吸光度,建立朗伯-比爾定律,解方程求出未知樣濃度與含量。
定性分析
使用分光光度計(jì)可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液,測(cè)定此溶液對(duì)每一種單色光的吸光度,然后以波長為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度—波長曲線,此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線,因此用吸收光譜曲線圖可以進(jìn)行物質(zhì)種類的鑒定[1]?;衔飳?duì)紫外光具有的吸收光譜特征:形狀、峰的數(shù)目、波長位置及λmax(化合物特性參數(shù))可作為定性依據(jù)進(jìn)行化合物鑒定、結(jié)構(gòu)分析、氫鍵強(qiáng)度測(cè)定、絡(luò)合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定。
應(yīng)用實(shí)例
隨著廣譜抗生素的使用,真菌感染比例越來越高,早期快速的診斷可以顯著降低患者的死亡率。(1-3)-β-D葡聚糖是真菌細(xì)胞壁上的特異成分,通過測(cè)定患者血清中(1-3)-β-D葡聚糖的含量可準(zhǔn)確反映出真菌感染的程度。(1-3)-β-D葡聚糖能特異性激活反應(yīng)主劑中一系列酶聯(lián)反應(yīng),最終產(chǎn)生顯色物質(zhì)pNA,從而引起溶液吸光度的變化,根據(jù)檢測(cè)溶液405nm處吸光度變化對(duì)(1-3)-β-D葡聚糖濃度進(jìn)行定量。
革蘭陰性菌細(xì)胞壁上脂多糖也可作為生物標(biāo)記物測(cè)定革蘭陰性菌的感染情況,革蘭陰性菌脂多糖可特異性激活反應(yīng)主劑中一系列酶聯(lián)反應(yīng),生成顯色物質(zhì)pNA,通過檢測(cè)溶液405nm處吸光度的變化對(duì)革蘭陰性菌脂多糖進(jìn)行定量。一瑞生物專注于侵襲性真菌診斷20余年,擁有全套真菌檢測(cè)方案,具備海洋生物開發(fā)平臺(tái)、抗體制備平臺(tái)、分子生物學(xué)開發(fā)平臺(tái)、全自動(dòng)醫(yī)療設(shè)備平臺(tái)、儀器+試劑產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)?;诜止夤舛确ㄑ邪l(fā)的真菌(1-3)-β-D葡聚糖檢測(cè)試劑盒和革蘭陰性菌脂多糖檢測(cè)試劑盒只需1.5h即可對(duì)相應(yīng)生物標(biāo)記物進(jìn)行精準(zhǔn)定量,達(dá)到早期、快速診斷的效果。

來源:AnyTesting