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聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

 

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：

①模板核酸的制備；

②引物的質(zhì)量與特異性；

③酶的質(zhì)量與特異性；

④PCR循環(huán)條件。

尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間，一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

 

Q：假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，正對(duì)照有條帶，樣品無條帶?

 

可能原因：

1.模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚；⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

 

2.引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增。

 

3.酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

 

4.Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

 

5.反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul，或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

 

6.物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

 

7.靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

 

解決方法：

1.純化模板并重新提取，并檢測(cè)模板是否含有抑制劑；

 

2.引物：①選定一個(gè)好的引物合成單位；②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等；

 

3.優(yōu)化 buffer，摸索鎂離子濃度或適當(dāng)加入 DMSO（小于 0.3%）；

 

4.提高退火溫度，增加延伸時(shí)間。

 

Q：假陽性，空白對(duì)照出現(xiàn)條帶

 

可能原因：

1.引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

 

2.靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，這種污染有兩種原因：

①整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決，操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

 

②空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

 

解決方法：

1.實(shí)驗(yàn)儀器高壓滅菌；

2.實(shí)驗(yàn)試劑（酶除外）高壓滅菌，離心管槍頭一次性使用；

3.規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作；

4.假陽性可通過巢式 PCR 解決，或者使用特異性較高的試劑盒擴(kuò)增。

 

Q：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶，PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

 

可能原因：

1.引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。

2.Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。

3.酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

 

解決方法：

1.必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物；

2.減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；

3.降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；

4.適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

 

Q：拖尾、彌散，PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。

 

可能原因：

1.酶量過多或酶的質(zhì)量差；

2.dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高；

3.退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多。

 

解決方法：

1.減少用酶量或使用特異性高的熱啟動(dòng)酶擴(kuò)增；

2.減少dNTP的濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度；

3.增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

 

Q：cDNA產(chǎn)量的很低？

 

可能的原因及解決辦法：

1.RNA模板質(zhì)量低；

2.對(duì)mRNA濃度估計(jì)過高；

3.反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足；

4.同位素磷32過期；

5.反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl。

 

Q：產(chǎn)生彌散（smear）條帶？

 

可能的原因及解決辦法：

1.在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高；

2.減少引物的用量；

3.優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)；

4.在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。

 

Q：產(chǎn)生大分子量的彌散條帶？

 

可能的原因及解決辦法：

1.大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的；

2.對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）。

 

Q：在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果？

 

可能的原因及解決辦法：

1.通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響；

2.有可能是引物二聚體的條帶。

 

Q：擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中？

 

可能的原因及解決辦法：

1.有可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物，建議將第一鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增；

2.另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

 

Q：為什么得不到RACE產(chǎn)物？

 

可能的原因及解決辦法：

1.加入Hela對(duì)照；

2.低質(zhì)量的RNA模板；

3.逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(zhǎng)模板cDNA的合成；

4.目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR；

5.目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因；

6.目的基因太長(zhǎng)而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長(zhǎng)cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR；

7.cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過高GC含量區(qū)；使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。