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摘要：

目的：對微小核糖核酸122（microRNA-122）的定量檢測技術(shù)進(jìn)行評估，探討其臨床應(yīng)用價值。

方法：采用miRFLP技術(shù)檢測企業(yè)校準(zhǔn)品、參考品和臨床樣本，評價該技術(shù)的分析性能與臨床檢測價值。

結(jié)果：該方法定量下限為183 copies/μL，檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線183~1500000 copies/μL。高濃度平均回收率113.2%，低濃度平均回收率94.2%，比例系統(tǒng)誤差為3.7%。人間精密度變異系數(shù)4.2%~1.3%；室間精密度變異系數(shù)6.4%~2.5%；批間精密度變異系數(shù)4.0%~1.5%；批內(nèi)精密度變異系數(shù)4.1%~1.7%。試劑盒放置4℃ 12小時后的檢測結(jié)果與預(yù)期靶值無明顯差異。采集化療后24小時內(nèi)43例腫瘤化療患者的血樣，并分離血漿進(jìn)行miRNA-122檢測，將檢測結(jié)果與現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行ROC方法學(xué)分析，CutOff值設(shè)定為14136copies/μL，與歐盟公布的PSHT HV健康志愿組（歐洲人群）miRNA-122的13356 copies/μL（95%）基本一致。

結(jié)論：基于miRNA的微小核糖核酸（miRNA-122）定量檢測技術(shù)具有性能優(yōu)良、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，有較高的臨床應(yīng)用價值。

 

微小核糖核酸是一類由19~22個核苷酸組成的非編碼RNA，主要參與調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)，如直接結(jié)合到mRNA的抑制或啟動子區(qū)域?qū)⒁种苹蛘叽龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄基因的翻譯。由于具有早期和精確診斷的應(yīng)用前景，檢測人體體液（包括血液、唾液、尿液和房水）中的miRNA早已受到關(guān)注。疾病相關(guān)miRNA的探索篩選工作也在不同的疾病領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。miRNA被脂質(zhì)或脂蛋白復(fù)合物包裹以一種相對穩(wěn)定的形式進(jìn)行體內(nèi)循環(huán)，因而可以作為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物被檢測。美國FDA科學(xué)家Shi Q在2013年撰文深入論述了血液microRNA，尤其是miRNA -122作為肝損害生物學(xué)指標(biāo)，具有顯著優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)志物（ALT）的臨床應(yīng)用前景，但也存在無標(biāo)準(zhǔn)化的定量檢測方法的問題。美國FDA在2015年8月20日發(fā)布了有關(guān)生物標(biāo)志物的報告，認(rèn)定miRNA-122作為臨床亟需（Critical Need）的急性肝毒性安全生物標(biāo)志物（非臨床和臨床），可應(yīng)用于藥物肝臟毒性的證明性研究、臨床劑量遞增的安全性研究及藥物誘發(fā)的肝損傷3種情況。

 

同時，美國FDA科學(xué)家Shi Q再次撰文論述了miRNA作為臨床生物標(biāo)志物的發(fā)展受制于缺少標(biāo)準(zhǔn)化定量檢測方法，并引用了一種免提取PCR-熒光毛細(xì)管電泳法技術(shù)，來闡述如何建立定量檢測方法，并認(rèn)為這是一種創(chuàng)新的檢測方法。

以往的工作中，利用一種免提取PCR-熒光毛細(xì)管電泳法技術(shù)，也稱作miRNA來源的片段長度多態(tài)性技術(shù)（miRFLP），通過免提取RNA技術(shù)可實(shí)現(xiàn)微量血漿和房水樣本（低至1 μL）的定量檢測。本文基于miRNA方法對微小核糖核酸122（miRNA-122）定量檢測的定量下限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率、精密度進(jìn)行評估，并應(yīng)用該技術(shù)對臨床腫瘤化療患者的血漿樣本進(jìn)行了檢測和驗(yàn)證。

 

1 材料與方法

 

1.1 樣本

本研究根據(jù)《赫爾辛基宣言》和《議定書》進(jìn)行。四川省腫瘤醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)。使用EDTA-NA2采血管抽取四川省腫瘤醫(yī)院接受化療治療的患者5 mL全血，采用800 g離心力離心10 min，取上層淡黃色液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管并立即置于-20 ℃保存?？偣彩占?3例腫瘤化療患者血樣。企業(yè)校準(zhǔn)品、參考品由成都諾恩基因科技有限公司提供。

 

1.2 儀器與試劑

儀器：Analytikjena PowerCycler pcr儀，VeritiTM PCR儀和ABI 3730 XL測序儀。

主要材料：Triton X-114（Sigma-Aldrich），Potassium chloride（Sigma-Aldrich），RT buffer（Takara），Magnesium sulphate（Sigma-Aldrich），dNTP（Sigma-Aldrich），MMLV reverse transcriptase（RT，Takara），RNase Inhibitor（RI，NewEngland Biolabs），PCR buffer（Sigma-Aldrich），JumpStart Taq DNAse（Sigma-Aldrich），MyOne Streptavidin C1（Life technologies），Ribonuclease A（RNase A，Takara），RNA序列、cDNA引物、PCR引物和生物素標(biāo)記歐米伽引物（南京金斯瑞生物科技有限公司產(chǎn)品）。

 

1.3 基于miRNA的微小核糖核酸122（miRNA -122）定量檢測技術(shù)

取5 μ L血漿樣本加入3 5 μ L樣本釋放劑（Triton X-114、氯化鉀、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、硫酸鎂、無核酸酶水），4 ℃ 10分鐘，75 ℃ 3分鐘，充分裂解包裹miRNA的外泌體，取8 μL裂解好的血漿分別加入1 μL內(nèi)對照、2 μL miRNA歐米伽探針和2 μL內(nèi)對照歐米伽探針，55 ℃ 5分鐘，1個循環(huán)；55 ℃ 1分鐘、20 ℃ 1分鐘，10個循環(huán)進(jìn)行雜交。交后加入4 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、鼠源RNA酶抑制劑）在37 ℃ 5分鐘，1個循環(huán)；55 ℃ 15秒、4 ℃ 1分鐘、20 ℃ 1分鐘、37 ℃ 30秒，40個循環(huán)；85 ℃ 5分鐘，1個循環(huán)條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后加入60 μL cDNA延伸反應(yīng)液[miR-122cDNA延伸引物、2×PCR buffer、dNTP、內(nèi)對照cDNA延伸引物、TaqDNA聚合酶、硫酸鎂、核糖核酸酶（牛胰）、無核酸酶水]在95 ℃ 2分鐘、60 ℃ 10分鐘，1個循環(huán)；72 ℃ 1分鐘、37 ℃ 3分鐘，20個循環(huán)；72 ℃ 5分鐘、95 ℃ 1分鐘，1個循環(huán)條件下進(jìn)行cDNA延長反應(yīng)。反應(yīng)后，加入磁珠（C1）進(jìn)行純化，用清洗液和無核酸酶水清洗，清洗后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。加入30 μL PCR反應(yīng)液（PCR擴(kuò)增正向引物、PCR擴(kuò)增反向引物、硫酸鎂、2×PCR buffer、dNTP），在95℃ 2分鐘、55℃ 10分鐘，1個循環(huán)；37℃ 3分鐘、55℃ 1分鐘，10個循環(huán)；72℃ 1分鐘，1個循環(huán)；95℃ 30秒、68℃ 3分鐘、72℃ 30秒，45個循環(huán)；72℃ 10分鐘，1個循環(huán)，60℃ 4小時，1個循環(huán)條件下，所有PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行競爭性同步擴(kuò)增，完成miRFLP的反應(yīng)步驟。將得到的PCR產(chǎn)物用10×TE（pH 7.0）進(jìn)行1:100的稀釋，采用熒光毛細(xì)管電泳ABI3730檢測。

 

1.4 性能評估

技術(shù)性能評估實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考《美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會批準(zhǔn)指南》（CLSI-EP）、《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》 和美國Roche公司的關(guān)于COBAS®6800/8800系統(tǒng)對HIV-1核酸定量檢測的性能評估。

 

1.4.1 精密度

在相同條件下（方法、試劑、儀器、參考品、實(shí)驗(yàn)室、操作員）對高、低兩個濃度（3.44、5.12 Log10 copies/μL）水平的樣本進(jìn)行檢測，每個樣本每日2個批次，每個批次測8次，共檢測5日，得到80個數(shù)據(jù)。從每個樣本10個批次中每批的8次變異系數(shù)算出批內(nèi)精密度。從每個樣本的80個結(jié)果計(jì)算出批間精密度。不同實(shí)驗(yàn)員在相同條件下（方法、試劑、儀器、參考品、實(shí)驗(yàn)室）對高、低兩個濃度水平的樣本進(jìn)行檢測，每個樣本各進(jìn)行16次重復(fù)檢測，計(jì)算得到人間精密度；成都諾恩基因科技有限公司在相同條件下（方法、試劑、參考品）對高、低兩個濃度水平的樣本進(jìn)行檢測，每個樣本各進(jìn)行16次重復(fù)檢測，計(jì)算得到室間精密度。

 

1.4.2 檢測限

將樣本稀釋成接近于方法標(biāo)準(zhǔn)曲線低限濃度水平的3個濃度樣本（1：366 copies/μL、2：183 copies/μL、3：92 copies/μL），將3個濃度樣本各進(jìn)行20次重復(fù)測定。

 

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)備13個不同濃度（1500000、375000、187500、93750、46875、23438、11719、5859、2930、1465、732、366、183 copies/μL）的樣本進(jìn)行檢測。對檢測結(jié)果和理論濃度進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，得到相關(guān)系數(shù)R2。

 

1.4.4 回收率

以樣本（1465 copies/μL）為標(biāo)準(zhǔn)樣本，分別制備48220、28932 copies/μL的待加入樣本。制備6份相同體積的待測物標(biāo)準(zhǔn)樣本。每2份中加入同一濃度待加入樣本，制成2個不同待加入濃度的回收樣本，計(jì)算加入的待測物濃度。在2份樣本中加入同樣量的無被測物的樣本稀釋液，制成基礎(chǔ)樣本。分別對回收樣本、基礎(chǔ)樣本和低濃度樣本進(jìn)行3次重復(fù)測定，取其均值進(jìn)行計(jì)算。

 

1.4.5 臨床樣本檢測

單點(diǎn)采集化療后24小時內(nèi)43例腫瘤化療患者的血樣，并分離血漿進(jìn)行miRNA-122檢測，同時參照2015版《藥物性肝損傷診治指南》進(jìn)行miRNA-122與現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)的ROC分析。現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)采用Roussel Uclaf因果關(guān)系評估法（RUCAM）。

 

2 結(jié)果

2.1 精密度

精密度結(jié)果見表 1。

表 1 精密度檢測結(jié)果

依據(jù)技術(shù)要求，該技術(shù)可以準(zhǔn)確地檢測miRNA-122，具有很好的穩(wěn)定性。

 

2.2 檢測限

結(jié)果顯示，濃度為366 copies/μL時檢出率是100%，濃度為183 copies/μL時檢出率是95%，濃度為92 copies/μL時檢出率是75%。依據(jù)技術(shù)要求，該技術(shù)定量下限為183 copies/μL。

 

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖 1，結(jié)合前面檢測限實(shí)驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線為183~1500000 copies/μL。結(jié)果表明，該技術(shù)具有較寬的標(biāo)準(zhǔn)曲線，適于臨床低濃度樣本的檢測。

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測結(jié)果

 

2.4 回收率

回收率結(jié)果見表 2。

表 2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度平均回收率為113.2%，低濃度平均回收率為94.2%，比例系統(tǒng)誤差為3.7%。依據(jù)技術(shù)要求，該技術(shù)具有很好的準(zhǔn)確性。

 

2.5 臨床樣本檢測

在現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)（ALT、R值）能夠診斷的病例中，以現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)（ALT、R值）為參照，對比miRNA-122的ROC分析（見圖 2）。miRNA-122與現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)（ALT、R值）具有較高的一致性，其AUC、P值、特異性及靈敏度均滿足臨床需求，初步確定的CutOff值設(shè)定為14136 copies/μL，該值與歐盟2016年9月30日公布的PSHT HV健康志愿組（歐洲人群）miRNA-122的13356 copies/μL（95%）基本一致。

 

圖 2 miRNA-122ROC分析圖

 

3 討論

 

血液中miRNA的檢測技術(shù)平臺主要有Northern blotting法、微陣列芯片法、RTqPCR。但Northern blotting法靈敏度低、耗時長；微陣列芯片法穩(wěn)定性和重復(fù)性差，無法實(shí)現(xiàn)定量檢測；RT-qPCR是最為廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù)，但該方法需要提取總RNA后再進(jìn)行檢測，樣本需求量大，同時還需要找到內(nèi)源性參考物來估量提取過程靶標(biāo)的損失，限制了它在臨床診斷中的應(yīng)用。

 

肝損傷評估最直觀的是病理形態(tài)學(xué)診斷方法，但手術(shù)禁忌癥多，只能反應(yīng)局部的變化，不能反應(yīng)出肝臟整體的情況。而miRNA-122具有更好的靈敏度和特異性、更小的個體間差異，潛在的分辨致命與非致命性肝損傷的能力以及反映肝損傷模式甚至病因?qū)W的能力。因此，miRNA-122具有肝損傷最佳標(biāo)志物的前景。本研究基于miRFLP的方法對微小核糖核酸122（miRNA-122）進(jìn)行定量檢測。該技術(shù)具有很好的穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性和較寬的檢測范圍，適用于低濃度樣本的檢測，可用于自動化分析，操作簡單，使用方便，各項(xiàng)檢測性能均可滿足臨床檢測要求，為臨床評估肝損傷提供了一種新的方法，適用于腫瘤患者化療過程中肝臟損傷的實(shí)時監(jiān)測，以及人體肝臟其他損傷情況的實(shí)時檢測。該方法應(yīng)用范圍廣泛，具有極高的臨床應(yīng)用價值。

作者：游延軍, 陳蕊, 蒲小聰, 彭靈犀, 胡澤斌, 高飛