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嘉峪檢測網(wǎng) 2019-03-06 16:00
葉綠素（Chlorophyll）是植物光合作用中的重要光合色素，可分為a、b、c、d四類。葉綠素不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等；葉綠素不很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會(huì)使其分解；葉綠素a分子式為C55H72O5N4Mg，酸性條件下，葉綠素a分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為脫鎂葉綠素；葉綠素a存在于所有的浮游植物中，大約占有機(jī)干重的1%～2%。
葉綠素a本身對環(huán)境沒有危害，但它是估算浮游植物生物量的重要指標(biāo)，可以通過測定水中浮游植物葉綠素a的含量，掌握水體的初級(jí)生產(chǎn)力情況和富營養(yǎng)化水平，在環(huán)境監(jiān)測中，葉綠素a含量是評(píng)價(jià)水體富營養(yǎng)化的指標(biāo)之一。
國外相關(guān)分析方法研究
ASTMD3731-87(2012)標(biāo)準(zhǔn)方法采用90%丙酮為提取試劑，玻璃纖維濾膜過濾水樣，研磨后4℃浸泡提取浮游植物的葉綠素。測定葉綠素的主要步驟如下:
（1）過濾：
抽濾前加入碳酸鎂懸濁液防止色素分解。負(fù)壓不能超過50kPa。
（2）葉綠素的提取：
先研磨，將濾膜放置于組織研磨器中，加入4-5ml 的90%丙酮溶液，500r/min 研磨3min。破碎濾膜上浮游植物藻類細(xì)胞。
然后浸泡提?。?/span>將破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至15ml 離心管中，用90%丙酮溶液沖洗研磨器及研磨杵一并轉(zhuǎn)入離心管，定容至10ml?；靹蚝?℃暗處浸泡提取。浸泡時(shí)間為15min 至24h。過程中要顛倒混勻數(shù)次。
最后離心澄清：1000g 離心20min 或過濾，將上清液轉(zhuǎn)移至旋塞玻璃小瓶中。
（3）測定方法：
分光光度法，三色方程測定664nm、647nm、630nm、750nm 吸光度計(jì)算葉綠素a、b、c 葉綠素含量。單色方程測定脫鎂葉綠素a 校正后的含量。
EPA446.0 采用90%丙酮為提取試劑，玻璃纖維濾膜過濾水樣，研磨后4℃浸泡提取藻類的葉綠素。主要測定步驟如下:
（1）抽濾：
采用玻璃纖維濾膜。將玻璃纖維濾膜放置在連接有真空泵的抽濾器上，負(fù)壓不超過20Kpa。輕輕攪拌或顛倒混勻樣品，準(zhǔn)確量取一定體積的水樣，緩慢減壓，水樣完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾。用鑷子將濾膜取出，帶有樣品一面向內(nèi)對折，用濾紙吸干剩余水分。如不及時(shí)提取，應(yīng)將濾膜放入培養(yǎng)皿中，外面包裹一層鋁箔，樣品濾膜-20℃暗處冷凍保存。
（2）研磨：
將濾膜剪成小塊放入組織研磨器管底，用大肚移液管加4ml 丙酮（90%），電動(dòng)研磨500 轉(zhuǎn)/分提取1 分鐘，注意保持避光及低溫。將懸濁液轉(zhuǎn)移至15ml 帶旋帽的離心管中，再用6ml 丙酮沖洗研磨棒及玻璃管轉(zhuǎn)移至離心管中。定容至10ml。時(shí)間5min。然后冷暗處保存。用清水及丙酮清洗研磨器后再處理下一個(gè)樣品。最后做一個(gè)空白膜。
（3）低溫浸泡：
然后用力震蕩離心管，4℃浸泡2～24 小時(shí)，期間至少震蕩2 到3 次。充分提取。
（4）離心：
浸泡后提取后，675g 離心15 分鐘。
（5）測定方法：
分光光度法，于750、664、647、630nm 處測定吸光度值，三色方程計(jì)算葉綠素a、b、c1＋c2；單色方程測定脫鎂葉綠素校正的含量。90%丙酮調(diào)零，弱光中傾倒或用移液管將離心上清液轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿中，750nm 吸光度值應(yīng)＜0.005AU，否則應(yīng)再次離心或通過玻璃纖維針式濾器。
標(biāo)準(zhǔn)的前處理操作同446.0，用熒光計(jì)進(jìn)行測定。
標(biāo)準(zhǔn)的前處理操作同446.0，提取液離心后，過0.45μm針式濾器過濾，取50~200μl樣品進(jìn)入高效液相色譜進(jìn)行分析，檢測波長為440nm。
《ISO 10260-1992》、《英國標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)BS ISO 10260：1992（2014）》、《日本JIS K0400-80-10：2000》。采用熱乙醇分光光度法測定葉綠素。主要步驟如下：
（1）提取方法：
可采用熱乙醇水浴法，準(zhǔn)確量取20～25ml 乙醇（90%），浸泡濾膜，擰緊聚四氟乙烯帽的玻璃小瓶旋塞。輕微震蕩懸浮濾膜。將玻璃瓶放入75℃水浴鍋中，液面與樣品一致。水浴5min，輕微震蕩。取出室溫冷卻15min。濾膜過濾或者離心，取上清液分光光度測定。也可采用熱乙醇研磨法：加入75℃熱乙醇30～50ml。用棒式研磨器研磨3min。過玻璃纖維濾膜，轉(zhuǎn)移至100ml（或50）容量瓶中，定容。
（2）測定方法：
將前處理后的上清液轉(zhuǎn)移至比色皿中，并留有足夠體積用于酸化待測。90%乙醇調(diào)零，測定665nm及750nm 吸光度值。注意：665nm 吸光度值0.01～0.8 之間，所以應(yīng)合適選擇過濾水樣體積、提取劑體積、比色皿量程。建議開始時(shí)選擇0.5L 水樣。用HCL（3mol/L）酸化提取液，用量每10mL 加0.01ml。震蕩，5～30min 后在665nm 處測定吸光度。國外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分析方法見表3。
比較國外測定葉綠素的方法可知，EPA 447.0 高效液相色譜法能夠很精確的測定各種光合色素的含量，但是儀器昂貴，分析操作步驟繁瑣，EPA 445.0 熒光光度計(jì)也能夠精確的測定葉綠素a 的含量，特別是能夠測定葉綠素含量較低的樣品，但是分析過程中容易受其他色素或色素衍生物的干擾，因此這兩種方法難以作為常規(guī)的監(jiān)測方法，而分光光度法由于操作簡單，成為最常用的葉綠素a 的測定方法。
國內(nèi)相關(guān)分析方法研究
（1）抽濾：
在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜，倒入定量體積的水樣進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)負(fù)壓不能超過50kPa。
（2）研磨：
水樣過濾后，取出帶有浮游植物的濾膜，在冰箱內(nèi)低溫干燥6～8h后放入組織研磨器中，加入少量碳酸鎂粉末及2～3ml90%丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。
（3）離心：
用離心機(jī)（3000～4000r/min）離心10min。將上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。再用2～3ml的90%丙酮，繼續(xù)研磨提取，離心10min。
（4）測定：
將上清液再轉(zhuǎn)入容量瓶中，重復(fù)1～2次，用90%的丙酮定容為5ml或10ml，搖勻。1cm比色皿，90%丙酮為參比溶液，750、663、645、630nm處測定吸光度值。
水利行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測定葉綠素的具體操作步驟如下：
（1）抽濾：
將玻璃纖維濾膜放置在連接有真空泵的抽濾器上，根據(jù)水樣中葉綠素的濃度準(zhǔn)確量取一定體積的混勻水樣進(jìn)行抽濾，負(fù)壓不超過20kPa，逐漸減壓，在水樣剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品一面對折，用濾紙吸干剩余水分。如果樣品不能及時(shí)提取，應(yīng)將吸干水分的濾膜放入培養(yǎng)皿中，外面包裹一層鋁箔，放入﹣20℃冰箱中保存。
（2）提取：
將過濾后的濾膜放入具塞玻璃離心管中，蓋緊塞帽。放入﹣40℃低溫冰箱中冷凍20min，取出放置于室溫下5min，此過程反復(fù)三次。向玻璃離心管中加入10ml 90%丙酮溶液，蓋緊塞帽劇烈搖振片刻，放置于4℃冰箱中，避光浸泡4～12h 備用，在浸泡過程中，應(yīng)搖動(dòng)2～3 次。
（3）離心：
將離心管放入離心機(jī)，以3500r/min 的速度離心15min。
（4）測定：
將離心后的上清液倒入1cm 比色皿中，以90%丙酮做參比，分別在750、664、647、630nm 波長處測定吸光度值。
（1） 過濾：
在過濾裝置上裝 還玻璃纖維濾膜，根據(jù)水體的營養(yǎng)狀態(tài)確定取樣體積，用量量筒量取一定量的混勻樣品，進(jìn)行過濾，最后用少量蒸餾水沖洗慮器壁。
（2） 研磨：
將濾膜剪碎，放入研缽或勻漿器中，加入6~8ml90%丙酮，在500~1000r/min轉(zhuǎn)速下研磨1~3min，濾膜完全磨成糊狀后，將勻漿器中的樣品倒入離心管中，再用少許90%丙酮沖洗勻漿器2~3次，倒入離心管中，蓋上管塞，搖動(dòng)后置于黑暗低溫處（冰箱）靜置，提取時(shí)間不少于8小時(shí)和不多于20小時(shí)。
（3） 離心：
將離心管放入離心機(jī)中，在3000~4000r/min轉(zhuǎn)速下離心10~15分鐘，將上清液移入具刻度離心管，再加少量90%丙酮于原抽提用的離心管中，再次懸浮沉淀物并離心，再將上清液合并，此操作應(yīng)重復(fù)1~2次，直至沉淀物不含色素為止，最后將提取后的上清液定容到10ml。
（4） 測定：
測定665nm和750nm處的吸光度，用0.1N鹽酸酸化后再測定750和665 nm處的吸光度，代入公式計(jì)算葉綠素a和脫鎂葉綠素a的濃度。
將一定量水樣用玻璃纖維濾膜過濾，以90%丙酮為提取液研磨提取水中浮游植物的葉綠素，離心后測定其750nm、664nm、647nm、630nm 波長下的吸光度值，計(jì)算葉綠素a 的含量。
測定葉綠素的具體操作步驟如下：
（1） 過濾：
在過濾裝置上裝 還玻璃纖維濾膜，根據(jù)水體的營養(yǎng)狀態(tài)確定取樣體積，用量量筒量取一定量的混勻樣品，進(jìn)行過濾，最后用少量蒸餾水沖洗慮器壁。
（2） 研磨：
將樣品濾膜放置于研磨裝置中，加入 3~4mL丙酮溶液，研磨至糊狀。補(bǔ)加3~4mL丙酮溶液，繼續(xù)研磨，并重復(fù)1~2次，保證充分研磨5min以上。將完全破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，用丙酮溶液沖洗研缽及研磨杵，一并轉(zhuǎn)移入離心管中，定容至10Ml。
（3） 浸泡提取：
將離心管中的研磨提取液充分震蕩混勻后，用鋁箔包好，放置于4攝氏度下避光浸泡提取2小時(shí)以上。
（4） 離心：
將離心管放入離心機(jī)，以3000~4000r/min的速度離心10min，然后用針式濾器過濾上清液得到葉綠素a的丙酮提取液待測。
（5） 空白試樣的配置：
用實(shí)驗(yàn)用水按照與試樣的制備相同的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白試樣的制備。
（6） 測定：
將試樣轉(zhuǎn)移至比色皿中，以丙酮溶液為參比溶液，于波長750nm、664nm、647nm、630nm處測吸光度。
國內(nèi)外方法中的各種實(shí)驗(yàn)條件總結(jié)如下：
（1）提取試劑：
除熱乙醇方法，國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)方法均采用90%丙酮作為提取試劑。EPA446.0 指出，90%丙酮溶液可以有效提取大部分藻類細(xì)胞中的葉綠素a，而且不產(chǎn)生其它衍生物。丙酮是國際上較為公認(rèn)的提取葉綠素的試劑。
（2）濾膜：
除《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》采用乙酸纖維濾膜外，均采用玻璃纖維濾膜。
（3）樣品保存方法：
樣品的保存條件各種方法略有不同，但水樣采集后均保證4℃冷藏保存，樣品濾膜可冷凍保存。而且葉綠素a 測定樣品濾膜冷凍后再研磨，可提高提取效率。如采樣后不立刻測定，-18℃下冰凍，再于室溫條件下融解，利用細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和細(xì)胞液濃度的增高引起溶漲，使胞壁結(jié)構(gòu)破碎引起葉綠素溶出。
（4）是否研磨及研磨后是否需要浸泡：
目前國內(nèi)也有很多文獻(xiàn)報(bào)道了對上述葉綠素a提取方法的改進(jìn)研究，如延長提取時(shí)間。水利部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《葉綠素a的測定分光光度法》（SL88-2012）葉綠素測定的主要操作是低溫反復(fù)冷凍提取-避光冷藏浸泡-離心，在EPA的446.0的基礎(chǔ)上改進(jìn)了提取方法?？紤]到不同地區(qū)儀器設(shè)備的能力差異，-40℃的超低溫冰箱不是所有的環(huán)境監(jiān)測部門均具備的儀器設(shè)備，所以將樣品濾膜的冷凍作為輔助的提取條件。
（5）計(jì)算公式及波長：
關(guān)于計(jì)算方法，主要有三色法和單色法，三色法主要考慮了葉綠素b 和葉綠素c 對測定的干擾，測定的是表觀葉綠素a 的含量（包括葉綠素a 與脫鎂葉綠素a 之和），單色法考慮脫鎂葉綠素a 的干擾.從方法的簡便性來說，三色法操作簡單，產(chǎn)生誤差幾率小，耗時(shí)比單色法短。
來源：實(shí)驗(yàn)與分析
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