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臨床微生物方法驗(yàn)證

 

01、顯微鏡檢查

 

顯微鏡檢查程序包括涂片制備、染色鏡檢和結(jié)果報(bào)告過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展各種類(lèi)型顯微鏡檢查（如革蘭染色、抗酸染色、墨汁染色等）前應(yīng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室使用的檢驗(yàn)程序進(jìn)行驗(yàn)證，并由經(jīng)培訓(xùn)有涂片鏡檢能力的實(shí)驗(yàn)室人員操作。檢查方法可包括手工染片法和自動(dòng)化染片法。所有樣品及其盛放容器均應(yīng)當(dāng)作有傳染性物質(zhì)，并按照實(shí)驗(yàn)室生物安全要求進(jìn)行操作。

 

驗(yàn)證要求

顯微鏡檢查程序的驗(yàn)證應(yīng)包括能力驗(yàn)證/實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人員比對(duì)（當(dāng)多

名人員從事該項(xiàng)目時(shí)）。如果沒(méi)有可獲得的能力驗(yàn)證或室間質(zhì)評(píng)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)自行組織實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)（宜與通過(guò)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室比對(duì)）。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開(kāi)展手工染片法和自動(dòng)化染片法，應(yīng)進(jìn)行兩種方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部比對(duì)。

 

比對(duì)方案

 

1 樣品數(shù)量

每項(xiàng)檢查應(yīng)使用至少 5 份樣品進(jìn)行驗(yàn)證，覆蓋全部樣品類(lèi)型，無(wú)菌樣品類(lèi)型包含陰性和陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先使用已知結(jié)果的留樣樣品，當(dāng)不可獲取時(shí)可采用模擬樣品。

 

2 檢驗(yàn)程序

按臨床標(biāo)本常規(guī)方式處理,由本崗位工作人員使用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)程序進(jìn)行涂片制備、染色、鏡檢、判讀。

 

3 結(jié)果報(bào)告

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室程序文件規(guī)定進(jìn)行結(jié)果報(bào)告，其中抗酸桿菌應(yīng)根據(jù)“分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)”

報(bào)告鏡檢結(jié)果。

 

4可接受標(biāo)準(zhǔn)

每項(xiàng)檢查的比對(duì)結(jié)果符合率≥80% 。

 

02、分離培養(yǎng)

 

以臨床血培養(yǎng)為例

 

血培養(yǎng)檢驗(yàn)程序包括從病人血液采集、運(yùn)送、接收、孵育及監(jiān)測(cè)的全過(guò)程。目前臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室血培養(yǎng)系統(tǒng)性能驗(yàn)證的主要目的是評(píng)估系統(tǒng)使用的培養(yǎng)基能否用于培養(yǎng)臨床常見(jiàn)微生物（包括酵母菌、厭氧菌、苛養(yǎng)菌等）以及儀器（自動(dòng)化系統(tǒng)）能否及時(shí)檢測(cè)出血液中的大部分病原菌。

血培養(yǎng)性能驗(yàn)證常用留樣驗(yàn)證和血培養(yǎng)系統(tǒng)平行比對(duì)兩種方法。血培養(yǎng)系統(tǒng)平行比對(duì)用于評(píng)估驗(yàn)證系統(tǒng)和參比系統(tǒng)檢出細(xì)菌能力的一致性，但需要樣本量大，臨床采樣有難度。留樣驗(yàn)證的優(yōu)點(diǎn)則在于可評(píng)估其檢測(cè)不常見(jiàn)病原菌的能力。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)醫(yī)院病人數(shù)量和地區(qū)、病種特征等具體情況和兩種方法的特點(diǎn)選擇其中一種適宜的驗(yàn)證方法，或兩種方法同時(shí)應(yīng)用。

 

 留樣驗(yàn)證

 

1 驗(yàn)證要求 

驗(yàn)證應(yīng)覆蓋臨床常見(jiàn)微生物,需氧成人/兒童血培養(yǎng)瓶驗(yàn)證菌株應(yīng)包括需氧/兼性厭氧革蘭陽(yáng)性菌、需氧/兼性厭氧革蘭陰性菌、苛養(yǎng)菌 （如：流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌等）和真菌，厭氧血培養(yǎng)瓶驗(yàn)證菌株應(yīng)包括兼性厭氧革蘭陽(yáng)性菌、兼性厭氧革蘭陰性菌、專(zhuān)性厭氧菌，其他特殊用途血培養(yǎng)瓶參照廠(chǎng)家要求選擇合適類(lèi)型菌株進(jìn)行驗(yàn)證。每種類(lèi)型至少１株，總體不少于 15 株。應(yīng)盡可能使用真實(shí)患者的臨床分離菌株（性能驗(yàn)證用臨床留樣菌株宜經(jīng)質(zhì)譜或 DNA 序列分析確認(rèn)）。對(duì)于特殊、苛養(yǎng)菌可使用標(biāo)準(zhǔn)菌株或質(zhì)控菌株。某些特殊菌株需要在培養(yǎng)瓶中加入無(wú)菌、未使用抗生素的廠(chǎng)家推薦血液標(biāo)本，如不加可能不生長(zhǎng)，如流感嗜血桿菌。

 

2 驗(yàn)證方案

模擬臨床血流感染患者的細(xì)菌含量，用留樣菌株進(jìn)行一系列稀釋?zhuān)臃N細(xì)菌的最

終濃度為 5-30CFU/瓶。若苛養(yǎng)菌需添加適量的新鮮無(wú)菌血液（成人瓶 5-10ml，兒童瓶1-3ml）后置于血培養(yǎng)系統(tǒng)上進(jìn)行培養(yǎng)、檢測(cè)。

 

3 可接受標(biāo)準(zhǔn) 

如果在廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出所有菌株則該方法通過(guò)驗(yàn)證。 3 天時(shí)間應(yīng)足以檢測(cè)出至少 95%的臨床相關(guān)細(xì)菌， 須具備苛養(yǎng)菌、真菌、厭氧菌等的檢出能力。 若未能檢出應(yīng)使用相同菌株進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。若仍不能檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室和/或制造商應(yīng)在臨床使用該系統(tǒng)前采取糾正措施。如果血培養(yǎng)儀升級(jí)，原系統(tǒng)和新系統(tǒng)的差別不大，培養(yǎng)瓶也沒(méi)有改變，那么由供應(yīng)商技術(shù)代表核查儀器性能即可，無(wú)需再次驗(yàn)證。功能核查將對(duì)孵育系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)以及軟件是否按照制造商規(guī)定運(yùn)行進(jìn)行評(píng)價(jià)。

 

血培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì)

 

1 驗(yàn)證要求

因血培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì)要求較高，并非強(qiáng)制要求執(zhí)行。同一廠(chǎng)家由同一系統(tǒng)控制采集數(shù)據(jù)的多個(gè)血培養(yǎng)模塊不需進(jìn)行比對(duì)。

檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì)允許根據(jù)患者情況和實(shí)驗(yàn)室條件來(lái)評(píng)價(jià)新系統(tǒng)的性能，通常比對(duì)所

需臨床標(biāo)本數(shù)量應(yīng)≥100 例。

 

2 驗(yàn)證方案 

同一病人按照同樣的采血方法采集血液標(biāo)本，接種驗(yàn)證血培養(yǎng)瓶和參考血培養(yǎng)瓶

中，分別放入各自的培養(yǎng)系統(tǒng)上進(jìn)行培養(yǎng)、檢測(cè)。

 

3 可接受標(biāo)準(zhǔn)

與參考方法相比，新培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)符合率至少為 95%。如果未能滿(mǎn)足性能要求,則該實(shí)驗(yàn)不能通過(guò)驗(yàn)證或者制造商和/或使用者須采取正確的糾正措施并再次進(jìn)行驗(yàn)證。

 

一般培養(yǎng)（非血液標(biāo)本）

 

一般培養(yǎng)包括各類(lèi)標(biāo)本（痰液、尿液、糞便、分泌物、組織等）的細(xì)菌（含厭氧菌、結(jié)核分枝桿菌）、真菌、支原體等的培養(yǎng)。培養(yǎng)程序包括標(biāo)本處理、接種、培養(yǎng)基選擇和適宜培養(yǎng)條件(溫度、氣體等)。實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展各種類(lèi)型標(biāo)本微生物培養(yǎng)檢驗(yàn)前應(yīng)針對(duì)培養(yǎng)目的對(duì)本實(shí)驗(yàn)室使用的檢驗(yàn)程序進(jìn)行驗(yàn)證。如果沒(méi)有可獲得的能力驗(yàn)證或室間質(zhì)評(píng)，實(shí)驗(yàn)室可采用培養(yǎng)基驗(yàn)證方法對(duì)培養(yǎng)程序進(jìn)行驗(yàn)證。使用質(zhì)控菌株或留樣菌株模擬標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，驗(yàn)證該培養(yǎng)程序是否滿(mǎn)足檢出性能要求。

 

 驗(yàn)證要求

每項(xiàng)檢查每種樣品類(lèi)型至少 1 份標(biāo)本。

培養(yǎng)基根據(jù)其用途主要分為兩種：選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基。選擇性培養(yǎng)基包含能夠抑制某些微生物生長(zhǎng)的抗生素或化學(xué)試劑，非選擇性培養(yǎng)基則不含抑制微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)，能夠促進(jìn)大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)。無(wú)論商品化培養(yǎng)基還是自配培養(yǎng)基，都需要在使用前對(duì)培養(yǎng)基性能進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證菌株可選擇質(zhì)控菌株或臨床菌株。

對(duì)于某些苛養(yǎng)細(xì)菌專(zhuān)用培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室必須確定該培養(yǎng)基能保證對(duì)應(yīng)苛養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)。如：厭氧菌、百日咳博德特菌、彎曲菌、螺桿菌、軍團(tuán)菌、淋病奈瑟菌、以及其他需要特殊生長(zhǎng)條件的細(xì)菌。而對(duì)于一些非選擇性培養(yǎng)基，如血平板和巧克力平板需保證其能支持大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)。

 

2 驗(yàn)證方案

標(biāo)準(zhǔn)菌株、能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)使用的菌株、從臨床病人標(biāo)本分離的具有穩(wěn)定表型的菌株均可用做驗(yàn)證菌株，實(shí)驗(yàn)室對(duì)其生化特征及鑒定結(jié)果應(yīng)做好相關(guān)記錄。

 

1 直接接種法

按照實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離培養(yǎng) SOP 直接接種菌株至培養(yǎng)基上，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。如果使用直接接種，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。接種菌量過(guò)多或者過(guò)少都將掩蓋培養(yǎng)基的促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)的特性。如果在使用直接接種法時(shí)出現(xiàn)驗(yàn)證不合格，則改用標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液進(jìn)行驗(yàn)證。

 

2 標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液法

不同實(shí)驗(yàn)室之間可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液驗(yàn)證比對(duì)。較高濃度的菌懸液能夠較好測(cè)試選擇性培養(yǎng)基抑制特定微生物生長(zhǎng)的能力。較低濃度的菌懸液則能夠驗(yàn)證非選擇性培養(yǎng)基充分支持細(xì)菌生長(zhǎng)的能力。

第一步：菌懸液的準(zhǔn)備 

（1）直接菌落法：使用培養(yǎng) 18 到 24 個(gè)小時(shí)的菌落，在 0.85%無(wú)菌生理鹽水中制成菌懸液，使其濁度達(dá) 0.5 麥?zhǔn)蠞岫取?/span>

（2）生長(zhǎng)法：從 24h 培養(yǎng)物中接種 3 到 5 個(gè)菌落至無(wú)菌肉湯以此制備懸浮液。孵育數(shù)小時(shí)使其濁度達(dá) 0.5 麥?zhǔn)蠞岫取?/span>

第二步：接種

（1）驗(yàn)證非選擇性培養(yǎng)基

用無(wú)菌肉湯或者生理鹽水將 0.5 麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙哼M(jìn)行 1:100 稀釋?zhuān)總€(gè)測(cè)試平板接種 10μl（0.01ml）懸浮液，均勻涂布。如果菌落過(guò)密，則可將菌液稀釋 1000 倍后再接種。

（2）驗(yàn)證選擇性培養(yǎng)基

用無(wú)菌肉湯或者生理鹽水將 0.5 麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙哼M(jìn)行 1:10 稀釋?zhuān)總€(gè)測(cè)試平板接種 10μl（0.01ml）懸浮液。如果菌落過(guò)密，則可將菌液稀釋 100 倍后再接種。

（3）驗(yàn)證培養(yǎng)管

用 10μL（0.01mL）未稀釋的 0.5 麥?zhǔn)蠞岫葢腋∫哼M(jìn)行接種。

培養(yǎng)溫度、氣體條件和培養(yǎng)時(shí)間執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室 SOP 文件規(guī)定。

 

3 可接受標(biāo)準(zhǔn)

3.1 在選擇性培養(yǎng)基上驗(yàn)證菌株長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落大小與預(yù)期相符、菌落形態(tài)典

型，并且能夠抑制特定微生物的生長(zhǎng)，可判定性能符合要求，驗(yàn)證合格。

3.2 在非選擇性培養(yǎng)基上驗(yàn)證菌株長(zhǎng)勢(shì)良好、 菌落大小與預(yù)期相符、菌落形態(tài)典型，血培養(yǎng)基上的溶血類(lèi)型符合，可判定非選擇性培養(yǎng)基驗(yàn)證合格。

 

03、活菌計(jì)數(shù)

 

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室需對(duì)中段尿、肺泡支氣管灌洗液等標(biāo)本進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)?；罹?jì)

數(shù)定量培養(yǎng)除驗(yàn)證對(duì)病原菌的分離能力外，還需對(duì)定量接種環(huán)進(jìn)行驗(yàn)證。定量接種環(huán)不如微量加樣器準(zhǔn)確，但仍不失為半定量培養(yǎng)或者稀釋的一種很好的方法，在允許 20%誤差存在時(shí)可以使用定量接種環(huán)。

 

1 驗(yàn)證要求

定量接種環(huán)使用前應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證（使用微量加樣器只需計(jì)量檢定），一次性定量接種環(huán)每批次應(yīng)抽樣驗(yàn)證。

 

2 驗(yàn)證方案

可以采用鉆頭法和浸染法兩種方法，鉆頭法適用于重復(fù)使用金屬環(huán)，浸染法適用于重復(fù)使用金屬環(huán)和一次性接種環(huán)。

浸染法較易于實(shí)施，方法如下：

第一步：配制Evans blue染液（EBD）。用蒸餾水稀釋Evans blue染液為1:500、1:1000、1:2000、1:4000。 

第二步：用1ul環(huán)取10環(huán)EBD原液至10ml蒸餾水中；10ul環(huán)取10環(huán)EBD原液至100ml蒸餾水中，或至10ml蒸餾水中后再稀釋10倍。

第三步：用722分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)比色，重復(fù)四次。

第四步：計(jì)算

1ul環(huán)和10ul環(huán)分別配置溶液的吸光度應(yīng)與1:1000EBD稀釋液相符。以1:1000稀釋液的吸光度為比對(duì)測(cè)定值，計(jì)算接種環(huán)定量配制溶液吸光度與比對(duì)測(cè)定值的偏差。

偏差=檢測(cè)測(cè)定值-比對(duì)測(cè)定值/檢測(cè)測(cè)定值×100%。

 

3 可接受標(biāo)準(zhǔn)

允許范圍：平均偏差不超過(guò) 20%。

 

04、微生物鑒定

 

包括傳統(tǒng)生化鑒定系統(tǒng)、質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)、分子生物學(xué)鑒定系統(tǒng)等。本次討論主要適用于商業(yè)化配套的傳統(tǒng)生化鑒定系統(tǒng)，質(zhì)譜和分子鑒定系統(tǒng)的驗(yàn)證可參考執(zhí)行，但還需滿(mǎn)足該技術(shù)的專(zhuān)項(xiàng)要求。

 

1 驗(yàn)證要求

按優(yōu)先順序依次選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株、質(zhì)控菌株或其它已知菌株，試驗(yàn)應(yīng)覆蓋實(shí)驗(yàn)室使用的全部卡片種類(lèi)和/或方法一些大型醫(yī)院，其患病人群更復(fù)雜、微生物種類(lèi)更多，這類(lèi)醫(yī)院應(yīng)對(duì)更多的菌株進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于特定地區(qū)和機(jī)構(gòu), 考慮到特殊標(biāo)本不易獲取以及病人等因素，驗(yàn)證菌株的選擇可適當(dāng)調(diào)整。

 

2 驗(yàn)證方案

菌株種類(lèi)的選擇應(yīng)參照廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)，覆蓋革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性非苛養(yǎng)菌、苛養(yǎng)菌、厭氧菌、念珠菌、隱球菌等。包括臨床留樣菌株和標(biāo)準(zhǔn)/質(zhì)控菌株。每種類(lèi)型應(yīng)至少 1株，總體不少于 20 株。按廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)或?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)程序規(guī)定對(duì)驗(yàn)證菌株進(jìn)行檢測(cè)，一般要求鑒定至種水平。對(duì)于特殊類(lèi)型的微生物（如棒狀桿菌、厭氧菌，芽孢桿菌），可將鑒定到屬的水平作為可以接受的性能標(biāo)準(zhǔn)。

 

3 可接受標(biāo)準(zhǔn)

標(biāo)準(zhǔn)/質(zhì)控菌株符合率應(yīng)為 100%，臨床菌株的符合率應(yīng)在 90％以上。若未能滿(mǎn)足要求,則該檢測(cè)系統(tǒng)不能通過(guò)驗(yàn)證或者制造商和/或使用者須采取措施。修正后的檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)再次進(jìn)行驗(yàn)證。

 

 血清學(xué)鑒定試驗(yàn)

血清學(xué)鑒定試驗(yàn)包括沙門(mén)菌/志賀菌/致病大腸桿菌/弧菌等的血清學(xué)分型。

 

1 驗(yàn)證要求

沙門(mén)菌至少包括傷寒沙門(mén)菌/甲型副傷寒沙門(mén)菌/乙型副傷寒沙門(mén)菌/丙型副傷寒沙門(mén)菌；志賀菌包括福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、痢疾志賀菌和鮑氏志賀菌四種；致病大腸桿菌/弧菌等根據(jù)當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政管理和實(shí)驗(yàn)室情況進(jìn)行選擇。優(yōu)先選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株和質(zhì)控菌株，也可使用實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)過(guò)的留樣臨床分離株。

 

2 驗(yàn)證方案

參照實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行操作。每種本地區(qū)常見(jiàn)血清型菌株至少 1 株。

 

3 可接受標(biāo)準(zhǔn)要求準(zhǔn)確率 100%。