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今天，咱們再好好聊聊ISO 10993-10:2010 皮膚致敏測試。

 

皮膚致敏測試概述

 

目前，有三種動物試驗可用于化學(xué)物質(zhì)的皮膚致敏測試，包括兩種豚鼠試驗和一種小鼠試驗。其中，最常用的是豚鼠最大限度法(GPMT)和豚鼠局部封閉敷貼法(Buehler test)。

 

GPMT是最敏感的測試方法，Buehler test是最適合于局部使用產(chǎn)品的測試方法，而小鼠局部淋巴結(jié)試驗(LLNA)是除豚鼠試驗外國際公認的用于測試單一化學(xué)物質(zhì)的測試方法。接下來，本文將從測試原則、測試樣本和動物準(zhǔn)備、測試過程、測試觀察以及結(jié)果和討論這幾部分，和大家梳理每種測試的要求。

 

 

小鼠局部淋巴結(jié)試驗(LLNA)

 

1.  測試原則 

在實驗動物的耳朵背部給與測試樣品，并在淋巴結(jié)中測量淋巴細胞的增殖程度（除耳朵部位）。若與對照組相比，試驗組的細胞增殖反應(yīng)為三倍及以上，則將該反應(yīng)定為測試材料為敏化劑的閾值。對于醫(yī)療器械產(chǎn)品，可使用未稀釋的提取液進行測試。

 

2.  測試樣本和動物準(zhǔn)備 

測試樣本可以是應(yīng)用于小鼠耳朵的液體、混懸液、膠體或粘性物質(zhì)。通常應(yīng)使用系列濃度進行測試，否則使用最高濃度。常用的提取液是丙酮橄欖油(AOO)4:1的混合物。若是親水性的且無法粘附于皮膚的液體樣本，則可加入羧甲基纖維素或羥乙基纖維素(0.5％w/v)。若是水溶性的化學(xué)物質(zhì)，則可添加二甲基亞砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。

但要注意的是，樣本制備過程中使用的任何提取液或添加物，都應(yīng)該進行驗證和記錄，證明其不會影響測試結(jié)果。

 測試動物應(yīng)優(yōu)選健康的CBA/Ca或CBA/J雌性小鼠（非懷孕，8-12周齡），其他選擇包括DBA/2、B6C3F1和BALB/c，小鼠應(yīng)在一周齡波動范圍內(nèi)進行匹配。動物選擇和飼養(yǎng)應(yīng)按照ISO 10993-2標(biāo)準(zhǔn)要求。

 

3.  測試過程 

對于化學(xué)物質(zhì)，LLNA測試通常以劑量-反應(yīng)方式進行。對于醫(yī)療器械，待測樣品因為是提取物，所以常用單劑量測試，而且不進行稀釋。但是，當(dāng)提取物含有高毒性成分時，可能會導(dǎo)致LLNA陰性反應(yīng)。因此，在研究高毒性提取物時，建議稀釋提取物并以劑量-反應(yīng)方式進行LLNA。

為確保測試再現(xiàn)性和靈敏度，可使用弱至中等接觸性過敏原進行測試，如巰基苯并噻唑、己基肉桂醛和苯佐卡因。研究期間應(yīng)進行動物體重測量及臨床觀察，并做好記錄。

 當(dāng)進行LLNA測試時，每組通常至少包含4只小鼠；當(dāng)只有一個劑量可供評估時，每組至少含5只小鼠。淋巴結(jié)反應(yīng)可以通過測量個體或匯集的淋巴結(jié)樣品來確定。

 

4.  細胞增殖測定 

淋巴結(jié)中的增殖細胞可標(biāo)記放射性或熒光標(biāo)記物。常用的放射性標(biāo)記為3H-甲基胸苷和125I-碘脫氧尿苷，對于熒光可使用氟脫氧尿苷。在LLNA最后一次處理后(72±2)h，記錄小鼠體重并靜脈注射標(biāo)記物用于細胞增殖測定。在注射標(biāo)記物后(5±0.75)h對小鼠實施安樂死，去除引流的耳廓淋巴結(jié)。用200μm不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)輕輕按壓淋巴結(jié)來制備單細胞制劑，通過離心將細胞制備物洗滌兩次并重懸于PBS中。細胞用5％三氯乙酸(TCA)在(4±2)℃下沉淀(18±1)h。離心后，將沉淀重懸于1ml TCA中，并轉(zhuǎn)移至含有10ml閃爍液的閃爍瓶中進行3H計數(shù)，或直接轉(zhuǎn)移至γ計數(shù)器進行125I計數(shù)。

 

5.  結(jié)果和討論  

以每小鼠每分鐘計數(shù)（cpm /小鼠）測量淋巴結(jié)細胞中的放射性水平。將每分鐘計數(shù)(cpm)轉(zhuǎn)換為每分鐘衰變(dpm)。計算每組小鼠的cpm或dpm的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，從每個結(jié)果中減去背景值，并確定刺激指數(shù)(SI)。三個及以上測試樣本的SI≥3，則被認為是陽性。

 

 

豚鼠最大限度法(GPMT)

 

1.  樣本和動物準(zhǔn)備 

測試樣本應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)附錄A進行制備，在不影響測試結(jié)果的前提下盡可能使用最高濃度。測試動物應(yīng)使用體重為300-500克、單一遠交系的健康成年白化豚鼠，或是未經(jīng)產(chǎn)或未懷孕的雌性豚鼠。

試驗組豚鼠數(shù)量至少為10只，對照組至少為5只。如果存在不明確的反應(yīng)或不確定結(jié)果，則對至少20只測試動物和10只對照動物進行新的研究。動物選擇和飼養(yǎng)需滿足ISO 10993-2標(biāo)準(zhǔn)要求。

 

2.  測試過程 

在開展主測試前，應(yīng)進行初步試驗，其目的是確定主試驗中的試樣濃度。將一系列稀釋的測試樣品局部應(yīng)用于動物側(cè)腹（至少三只），24小時后取出封閉敷料和貼劑，并使用下表中給出的分級標(biāo)準(zhǔn)評估應(yīng)用部位的紅斑和水腫。對于主測試中的局部誘導(dǎo)階段，選擇導(dǎo)致輕度至中度紅斑的最高濃度；對于主測試中的激發(fā)階段，選擇不產(chǎn)生紅斑的最高濃度。

 

• 皮內(nèi)誘導(dǎo)階段 

如下圖所示，在肩胛內(nèi)區(qū)域，對每只動物進行0.1ml皮內(nèi)注射。位點A：弗氏完全佐劑與所選溶劑按體積比1:1混合成穩(wěn)定乳液。位點B：試驗樣品（未稀釋的提取物）；用溶劑注射對照動物。位點C：將位點B使用的濃度的測試樣品，與弗氏完全佐劑按體積比1:1混合成穩(wěn)定乳液；向?qū)φ談游镒⑸淇瞻滓后w與佐劑的乳液。

 

• 局部誘導(dǎo)階段 

在皮內(nèi)誘導(dǎo)階段完成后(7±1)天，在每只動物的肩胛內(nèi)區(qū)域，局部使用約8cm2的貼片（濾紙或吸收性紗布）給予測試樣品。使用皮內(nèi)誘導(dǎo)期中選擇的濃度用于B點，若達到的最大濃度不產(chǎn)生刺激，則用10％十二烷基硫酸鈉按摩皮膚預(yù)處理該區(qū)域(24±2)h。使用封閉敷料固定貼片，(48±2)h后取下敷料和貼劑。

 

• 激發(fā)階段 

在局部誘導(dǎo)階段完成后(14±1)天，通過局部施用將試驗樣品和空白置于誘導(dǎo)期未處理的部位，例如每只動物的上腹部，使用位點C選擇的濃度將貼片浸泡在試驗樣品中。采用封閉式敷料固定，(24±2)h后取下敷料和貼劑。

 

3.  動物觀察 

在去除敷料后，在全光譜光線下，觀察試驗組和對照組動物（24±2）h和（48±2）h的激發(fā)皮膚部位的外觀。并對每個部位和每個時間間隔的進行分級，描述和評定皮膚對紅斑和水腫的反應(yīng)。

 

4.  結(jié)果評估 

如果對照組等級小于1，試驗組等級大于等于1則為致敏。如果對照徐等級大于等于1，試驗組超過對照組中最嚴(yán)重的反應(yīng)則為致敏；如果出現(xiàn)疑似反應(yīng)，應(yīng)進行再激發(fā)已確認首次激發(fā)結(jié)果。

 

 

豚鼠局部封閉敷貼法(Buehler Test)

 

1.  樣本和動物準(zhǔn)備 

該部分的要求與“三.1”保持一致。

 

2.  測試過程 

對于所有局部應(yīng)用的產(chǎn)品，用測試材料或提取物使適當(dāng)尺寸的貼劑（濾紙或吸收性紗布）飽和，并將貼劑施加到封閉敷料下的剔除毛發(fā)區(qū)域(6±0.5)h。在開展主測試前，同樣應(yīng)進行初步試驗，使用適當(dāng)?shù)馁N劑將四種濃度的測試樣品局部給與動物的側(cè)腹（至少三只）。在(6±0.5)h后取出封閉敷料和貼劑，在貼劑去除后(24±2)h和(48±2)h評估應(yīng)用部位的紅斑和水腫，選擇：a）對于誘導(dǎo)階段，不引起輕微紅斑的最高濃度；b）對于激發(fā)階段，不產(chǎn)生紅斑最高濃度。

 

• 誘導(dǎo)階段 

將貼劑浸泡在一定濃度的測試樣品中，施用于每只動物的左上背部區(qū)域，在(6±0.5)h后取下，執(zhí)行此程序的頻率為每周三天，并為期三周。同時使用空白液體作為對照。

 

• 激發(fā)階段 

在最后一次誘導(dǎo)后(14±1)d，用測試樣品激發(fā)所有測試和對照動物。將貼劑浸泡在一定濃度的測試樣品中，通過單次局部施用，將測試樣品施用于每只動物的剪切的未測試區(qū)域。在（6±0.5）h后取下限制器和封閉敷料和貼劑。

 

3.  動物觀察

 

在初次或再次激發(fā)后(24±2)h，使用表4對測試部位進行分級。在去除激發(fā)貼片后(48±2)小時重復(fù)分級。在自然光譜或全光譜照明下，觀察皮膚反應(yīng)。

 

4.  結(jié)果評估

 

如果對照組等級小于1，試驗組等級大于等于1則為致敏。如果對照徐等級大于等于1，試驗組超過對照組中最嚴(yán)重的反應(yīng)則為致敏；如果出現(xiàn)疑似反應(yīng)，應(yīng)進行再激發(fā)已確認首次激發(fā)結(jié)果。