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糖類不僅是生命體的基本組成部分和重要營養(yǎng)物質(zhì)，還參與眾多生物體的生命活動(dòng)，糖分析是研究其在生命體轉(zhuǎn)化和生理作用的前提和重要手段。由于單糖是構(gòu)成多糖的基本單元，多糖分析一般通過多糖Smith降解得單糖?二糖等低聚糖，定量分析降解產(chǎn)物來確定多糖的組成，然后通過其他手段確定糖連接方式和空間結(jié)構(gòu)，因此單糖和二糖的定量分析是多糖分析的基礎(chǔ)。單糖和二糖還是制藥工業(yè)的基本營養(yǎng)補(bǔ)充劑和藥物輔料，也是食品工業(yè)的重要添加劑。因此，準(zhǔn)確測定單糖和二糖的含量不僅是保證食品?藥品安全的需要，也是多糖分析的基礎(chǔ)?

 

單糖和二糖為多羥基醛?酮及其衍生物，極性大，缺乏光學(xué)吸收基團(tuán)，使用常規(guī)的紫外分光光度法(UV)?高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)?高效毛細(xì)管電泳-紫外法(HPCE-UV)和氣相色譜法(GC)直接分析受到很大限制?長期以來，單糖和二糖分析一直具有挑戰(zhàn)性，成為制約整個(gè)糖類研究領(lǐng)域發(fā)展的瓶頸。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，單糖和二糖的定量分析技術(shù)取得了長足進(jìn)步，分析工作者發(fā)展了單糖和二糖的定量分析方法，下面我們就來深入了解各種分析方法的特點(diǎn)及應(yīng)用，并重點(diǎn)介紹幾種最有前途的方法，以期給糖類分析提供啟發(fā)和借鑒。

 

經(jīng)典分析方法

 

經(jīng)典分析方法包括重量法、滴定法、旋光法和比色法。由于方法缺乏專屬性，僅用于糖單質(zhì)或總糖量的定量分析。

 

重量法和滴定法的原理都是利用糖的還原性，使糖與氧化性試劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)。

 

重量法中糖與堿性銅試劑反應(yīng)，生成紅色的氧化亞銅沉淀，濾取沉淀稱重，由門生一華克葡萄糖換算表查出試樣相當(dāng)于葡萄糖的含量。由于該法需稱定沉淀的質(zhì)量，操作繁瑣且易產(chǎn)生誤差，現(xiàn)基本不再使用。

 

滴定法有亞碘酸鈉滴定法、硫酸鈰滴定法、斐林試劑熱滴定法、SHS堿性銅試劑滴定法等，目前中國藥典（一部）中含葡萄糖的注射液采用滴定法測定葡萄糖含量，由于方法不具備分離功能，只能用于還原糖的單質(zhì)或總還原糖的定量分析。

 

旋光法是利用糖的旋光性測定糖單質(zhì)的含量，目前糖單質(zhì)測定使用較多，如葡萄糖注射液和果糖的測定采用旋光法。該法不需要大型儀器，快速、簡便。

 

傳統(tǒng)比色法包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚法。其中前兩種方法用于測定己糖，后一種方法用于戊糖的測定。比色法的原理是通過化學(xué)反應(yīng)使單糖形成有色物質(zhì)后測其吸收度，用葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得樣品吸光度后查標(biāo)準(zhǔn)曲線得總糖量。方法同樣不具備專屬性，無法確定樣品的具體組成。

 

近紅外光譜法和拉曼光譜法

 

近紅外光譜法（NIR）和拉曼光譜法均為無損檢測技術(shù)，可用于樣品快速分析和原位在線分析，特別適用于含糖食品、藥品的快速分析和生產(chǎn)控制。

 

兩種方法分析步驟基本一致，包括：

 

① 收集樣品，分校正集和預(yù)測集兩組；

 

② 采集校正集圖譜，經(jīng)圖譜預(yù)處理、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取數(shù)據(jù)、建立預(yù)測模型；

 

③ 錄制預(yù)測集數(shù)據(jù)并驗(yàn)證模型；

 

④ 樣品分析。

 

但這兩種方法均需使用大量批次的樣品借助化學(xué)計(jì)量學(xué)法建立和驗(yàn)證模型，而且檢測準(zhǔn)確度受建模所用樣品的數(shù)量、品質(zhì)影響較大。

 

薄層掃描法

 

薄層掃描法（TLCS）分離效能高，消耗低，測定復(fù)雜樣品時(shí)不存在色譜堵塞的問題，但方法在精密度和準(zhǔn)確度方面較其他色譜法差，故應(yīng)用較少。

 

氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

 

由于單糖和二糖極性大、不易氣化，使用氣相色譜法測定時(shí)，需要化學(xué)衍生增加被測組分的揮發(fā)性，衍生方法有硅烷化和乙酰化。

 

氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）不僅能定量分析，儀器自帶的譜庫對(duì)定性分析也有很大的優(yōu)勢。

 

GC特別是GC-MS常用于多糖組成分析，但衍生反應(yīng)不僅耗時(shí)長，衍生化的復(fù)雜操作也影響了準(zhǔn)確度。

 

液相色譜法

 

液相色譜法能滿足絕大多數(shù)糖類測定要求，是應(yīng)用最廣、使用最多的色譜測糖技術(shù)，按使用的檢測器不同，分為紫外檢測器（UV）（包括二極管陣列檢測器，DAD）和通用檢測器兩類。通用檢測器有示差折光檢測器（RID）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、質(zhì)譜檢測器（MS）和電化學(xué)檢測器等。

 

高效液相色譜-示差檢測法（HPLC-RID）為許多標(biāo)準(zhǔn)使用的單糖和二糖檢測方法，如《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》和中國藥典均采用HPLC-RID測定蜂蜜中的單糖和二糖，中國藥典中許多單糖也采用該法測定。但RID使用梯度洗脫時(shí)會(huì)發(fā)生極限漂移，影響定量的準(zhǔn)確度。

 

ELSD是HPLC檢測不含生色團(tuán)物質(zhì)的常用檢測器，但基線平衡時(shí)間長、不能使用含鹽流動(dòng)相。

 

質(zhì)譜檢測器可用于結(jié)構(gòu)解析，具備同時(shí)定性、定性的優(yōu)勢，但LC-MS目前沒有譜庫，需人工解析定性，不如GC-MS使用方便。

 

由于單糖和二糖不具備生色團(tuán)，只在低波長區(qū)有吸收，信號(hào)受干擾大，使用高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）時(shí)，常需要化學(xué)衍生使糖鏈帶上生色團(tuán)以滿足光學(xué)檢測要求。產(chǎn)生紫外發(fā)色團(tuán)的衍生方法有還原氨基化法、3-(4-羧基苯甲?；?-2-喹啉甲醛法，1-對(duì)甲氧基苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮法（PMP）等，其中PMP由于具有衍生條件溫和、不產(chǎn)生立體異構(gòu)體、不損失唾液酸等優(yōu)點(diǎn)最為常用。

 

HPLC分析無生色團(tuán)物質(zhì)的另一種方法是采用熒光衍生化，常用的熒光衍生試劑有對(duì)氨基苯甲酸和2-(12-苯唑[b]吖啶-5(12H)-yl)-乙酰肼（BAAH）兩種。

 

化學(xué)衍生法雖然可提高方法的靈敏度，但衍生反應(yīng)操作復(fù)雜、耗時(shí)長，衍生反應(yīng)完全程度受試驗(yàn)條件影響，定量結(jié)果重現(xiàn)性差。

 

離子色譜法

 

離子色譜法（IC）是近二十年來發(fā)展起來的離子和極性物質(zhì)分析法，常用檢測器是電導(dǎo)檢測器，其他檢測器還有安培、紫外、原子吸收、原子發(fā)射、質(zhì)譜和蒸發(fā)光散射檢測器等。安培檢測器適用于解離度低、具有氧化還原性物質(zhì)的檢測，由于糖類多具有還原性，常采用脈沖安培檢測器（PAD）。分析單糖、二糖時(shí)，樣品稀釋后直接進(jìn)樣，組分在色譜柱上經(jīng)過離子交換和疏水等作用實(shí)現(xiàn)分離，通過脈沖安培檢測器檢測。

 

按載體材料不同，IC的色譜柱分為有機(jī)聚合物載體填充柱和無機(jī)載體填充柱兩種，前者既可以用于陽離子又可用于陰離子分析，填充劑在較寬的酸度（pH0~14）內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性，后者一般適用于陽離子分析，硅膠載體填充劑只在pH2~8的洗脫液中穩(wěn)定。按載體上鍵合的交換功能基團(tuán)不同，IC的色譜柱分為陰離子交換柱和陽離子交換柱，糖類分析一般使用以有機(jī)聚合物為載體的陰離子交換柱，常見的有戴安CarboPacPA系列和瑞士萬通的Metrosep Carb系列。

 

文獻(xiàn)報(bào)道的糖類測定多采用高效陰離子交換-脈沖安培檢測法(HPAE-PAD)，且多采用梯度洗脫。

 

HPAE-PAD測定糖時(shí)無需衍生，可直接進(jìn)樣測定，樣品處理方法簡單，分離效能好，可同時(shí)測定多種糖及其糖醛酸，靈敏度可媲美衍生-HPLC-UV，儀器價(jià)格適中，淋洗液主要是氫氧化鈉等無機(jī)試劑的水溶液，不像HPLC消耗有機(jī)溶劑，試驗(yàn)消耗低、環(huán)境友好，但理想的電極材料較少，有時(shí)存在信號(hào)穩(wěn)定性差的問題。

 

毛細(xì)管電泳法

 

衍生化-毛細(xì)管區(qū)帶電泳紫外檢測法

 

毛細(xì)管電泳法（HPCE）分離效能高，可同時(shí)分離多達(dá)十幾種糖，特別適用復(fù)雜多糖水解樣品的分析。

 

HPCE檢測器有UV檢測器、激光誘導(dǎo)熒光檢測器、電化學(xué)檢測器、MS檢測器等，糖檢測多使用UV檢測器，但由于缺少吸收基團(tuán)，檢測前常需進(jìn)行化學(xué)衍生。

 

HPCE分離機(jī)制有毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細(xì)管等速電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜等，糖分析以CZE為主。

 

常規(guī)的HPCE測糖方法是進(jìn)樣前對(duì)糖進(jìn)行化學(xué)衍生，采用CZE模式分離，以UV檢測器檢測，即衍生化-毛細(xì)管區(qū)帶電泳紫外檢測法（衍生法化-HPCE-UV）。

 

與HPLC-UV類似，衍生化-HPCE-UV衍生操作耗時(shí)、技術(shù)要求高、加上HPCE進(jìn)樣不夠精確，結(jié)果重現(xiàn)性較差。

 

非衍生-毛細(xì)管區(qū)帶電泳中紫外直接檢測法

 

ROVIO等采用非衍生-毛細(xì)管區(qū)帶電泳中紫外直接檢測法，以彈性石英毛細(xì)管柱為分離柱，130mmol/L的NaOH+30mmol/L的Na2HPO4溶液(pH12.6)為運(yùn)行緩沖溶液，測定波長為270nm，不經(jīng)衍生化直接測定了紙漿?果汁和白蘭地中的中性糖的含量，通過方法優(yōu)化，在40min內(nèi)一次最多同時(shí)測定12種糖，其中單糖10種，二糖2種，靈敏度與衍生化-HPCE-UV相近，方法顯示了糖測定方面的誘人前景。

 

這種方法顛覆了單糖?二糖在中紫外區(qū)無吸收的共識(shí)，ROVIO等給出的解釋是紫外吸收來自糖醛基或糖酮基烯醇化后在堿性條件下產(chǎn)生的醇鹽，但這種觀點(diǎn)無法解釋大多數(shù)二糖在270nm處的吸收原因，因?yàn)樵S多二糖缺少羰基而不能發(fā)生烯醇化。

 

SARAZIN等通過對(duì)ROVIO等方法的進(jìn)一步的研究，對(duì)單糖?二糖在中紫外區(qū)吸收機(jī)理做了另外的解釋，認(rèn)為糖在檢測窗口起了光化學(xué)降解反應(yīng)，產(chǎn)生了烯醇化丙二醛鹽中間體，這可能是糖在270nm附近產(chǎn)生紫外吸收的原因，并通過巧妙的試驗(yàn)設(shè)計(jì)證明光化學(xué)反應(yīng)被200nm以下的紫外光激發(fā)，而且通過試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)中間體存在時(shí)間非常短暫。SARAZIN等給出的葡萄糖降解反應(yīng)見下圖：

葡萄糖光化學(xué)降解途徑

 

之后還有報(bào)道顯示，非衍生-HPCE-CZE-UV在分離度?回收率?信號(hào)強(qiáng)度?適用性等方面均優(yōu)于HPLC。

 

ROVIO等還對(duì)影響糖分離的各種條件，如毛細(xì)管長度，分離程序，運(yùn)行緩沖溶液的濃度?酸度進(jìn)行了深入研究，并考察了組成緩沖溶液電解質(zhì)的作用。該團(tuán)隊(duì)的扎實(shí)工作和SARAZIN等的出色理論解釋為單糖和二糖的定量分析提供了一種全新的途徑。

 

展  望

 

多糖組成的多樣性決定了其分析方法需要采用色譜法，而單糖和二糖難揮發(fā)和無生色團(tuán)的特點(diǎn)又限制了多數(shù)色譜法的直接使用，HPAE-PAD和非衍生-HPCE-UV無需復(fù)雜的化學(xué)衍生直接測定，克服了經(jīng)典色譜法測定單糖和二糖的缺點(diǎn)，顯示了廣闊的應(yīng)用前景。

 

容量法、旋光法和比色法

 

經(jīng)典測糖法中，容量法除用于總還原糖測定外，還可用于旋光性藥物的葡萄糖溶液測定；旋光法可用于糖單質(zhì)測定。這兩種方法由于儀器價(jià)廉、操作簡便，在食品藥品質(zhì)量控制領(lǐng)域仍有較大實(shí)用價(jià)值。

 

比色法不具備分離功能，用于多糖水解物測定時(shí)，只能粗略測定總糖量，對(duì)多糖分析意義不大，且操作比容量法、旋光法復(fù)雜，隨著色譜技術(shù)的發(fā)展和儀器普及，使用會(huì)越來越少。

 

衍生化的GC、HPLC、HPCE

 

衍生化的GC?HPLC?HPCE盡管目前仍為糖分析的研究熱點(diǎn)，除非能克服衍生反應(yīng)耗時(shí)長?操作復(fù)雜和不易重現(xiàn)的缺點(diǎn)，否則會(huì)逐漸被其他色譜法取代。

 

HPLC-RID、HPLC-ELSD和TLCS

 

HPLC-RID盡管在藥典和食品標(biāo)準(zhǔn)方法中廣泛使用，但由于限制使用梯度洗脫和平衡時(shí)間長的缺點(diǎn)，會(huì)逐步被其他方法取代。HPLC-ELSD由于近年來儀器的普及，會(huì)在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)作為糖類定量分析的主流方法，但其對(duì)含鹽流動(dòng)相使用的限制和基線平衡時(shí)間長的缺點(diǎn)會(huì)影響其在糖分析中的長期應(yīng)用。TLCS低準(zhǔn)確度的缺點(diǎn)會(huì)繼續(xù)阻礙其廣泛應(yīng)用。

 

LC-MS和GC-MS

 

LC-MS和GC-MS盡管儀器昂貴且測糖時(shí)多數(shù)情況下需要衍生化樣品，但二者兼有定性、定量功能使其在多糖分析中有不可替代的優(yōu)勢，會(huì)繼續(xù)在多糖分析中發(fā)揮作用。

 

NIR和拉曼光譜法

 

隨著便攜式儀器的發(fā)展，在食品藥品質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域的糖快速分析方面，二者會(huì)發(fā)揮越來越重要的作用，隨著光纖技術(shù)的成熟，NIR和拉曼光譜法作為無損檢測技術(shù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)單糖和二糖工業(yè)生產(chǎn)的在線控制方面有著美好前景。

 

HPAE-PAD和非衍生-HPCE-UV

 

HPAE-PAD靈敏度高，淋洗液環(huán)境友好?價(jià)廉，儀器價(jià)格適中，是最有前途的單糖和二糖定量分析方法之一，隨著電極材料和色譜柱的多樣化及儀器的普及，在單糖和二糖測定中應(yīng)用必將越來越多。

 

非衍生-HPCE-CZE-UV既有分離效能高?分離模式多樣，適合復(fù)雜樣品分離的優(yōu)勢，又有無需對(duì)糖衍生，樣品處理簡單?測定快速?試驗(yàn)消耗低等優(yōu)點(diǎn)，采用內(nèi)標(biāo)法定量可顯著提高定量準(zhǔn)確度，滿足準(zhǔn)確分析要求，是糖分析最有競爭力的手段，隨著儀器普及和研究深入，可以預(yù)見，該方法將為復(fù)雜糖類化合物的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析提供強(qiáng)大的支撐。