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作者：張丹（航天中心醫(yī)院臨床藥理室)

編輯：春雪

作者簡(jiǎn)潔：張丹，女，工程師，碩士，主要從事藥物分析和藥動(dòng)學(xué)研究。

[摘要]生物等效性試驗(yàn)是藥品研發(fā)和評(píng)價(jià)的一個(gè)重要內(nèi)容。生物等效性試驗(yàn)首選藥動(dòng)學(xué)研究的方法．藥動(dòng)學(xué)研究則必然涉及到生物分析，因此生物分析對(duì)于生物等效性試驗(yàn)具有舉足輕重的作用，其結(jié)果的可靠性將直接影響生物等效性試驗(yàn)的質(zhì)量。但我國(guó)目前卻沒(méi)有完整、獨(dú)立的生物分析方面的指導(dǎo)原則。基于上述原因，我們根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)指導(dǎo)原則，并盡可能結(jié)合我們的實(shí)際工作，探討生物等效性試驗(yàn)中生物分析需注意的關(guān)鍵問(wèn)題。

 

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許多注冊(cè)類別的藥品(如創(chuàng)新藥、藥物新劑型、仿制藥、部分補(bǔ)充申請(qǐng)的藥品)研發(fā)和評(píng)價(jià)都涉及到生物等效性試驗(yàn)，其中藥物新劑型、仿制藥、補(bǔ)充申請(qǐng)的藥品在完成生物等效性試驗(yàn)后即可能被批準(zhǔn)上市，而不需要進(jìn)行其他臨床研究。另外，目前我國(guó)的藥品質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)也會(huì)更多地涉及到生物等效性試驗(yàn)，足見(jiàn)生物等效性試驗(yàn)在藥品研發(fā)和評(píng)價(jià)中的重要性。生物等效性研究的方法包括體內(nèi)和體外的方法，按方法的優(yōu)先考慮程度從高到低排列：藥動(dòng)學(xué)研究方法、藥效學(xué)研究方法、臨床比較試驗(yàn)方法、體外研究方法。首選藥動(dòng)學(xué)研究的方法必然涉及到生物分析。藥動(dòng)學(xué)方法是采用人體生物利用度比較研究的方法，通過(guò)測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)的生物樣本(如全血、血漿、血清或尿液)中藥物濃度，得出與吸收程度和速度有關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)．經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較后判斷制劑間是否具有生物等效性。因此生物分析對(duì)于生物等效性試驗(yàn)具有舉足輕重的作用，其結(jié)果的可靠性將直接影響生物等效性試驗(yàn)的質(zhì)量。

 

歐洲藥品管理局(EuropeanMedicinesAgency。EMA)和美國(guó)食品和藥物管理局(USFoodandDrugAdministration．FDA)均有生物分析方面的指導(dǎo)原則，我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(ChinaFoodandDurgAdministration，CFDA)雖有指導(dǎo)原則涉及相關(guān)內(nèi)容，但卻不完整、不獨(dú)立。目前，中國(guó)生物分析協(xié)會(huì)(ChinaBioanalysisFourm。CBF)正在討論中國(guó)藥典2015年版的生物分析指導(dǎo)原則草案(《生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則(草案)》)，旨在提供建設(shè)性的意見(jiàn)。該草案則主要參考了EMA的“Guidelineonbioanalyticalmethodvalidation”(2011)、FDA的“GuidanceforIndustry，BioanalyticalMethod Validation”(2001)、中國(guó)藥典2010年版的《藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》中“生物樣品分析方法的基本要求”、以及CFDA相關(guān)指導(dǎo)原則中涉及生物樣品定量分析方法的內(nèi)容(2005)。EMA的“Guidelineonbioanalyticalmethodvalidation”(2011)中共8次提及“生物等效性試驗(yàn)”，EMA、FDA除上述指導(dǎo)原則外．另有與生物等效性試驗(yàn)中生物分析相關(guān)的指導(dǎo)原則，再次體現(xiàn)了生物分析在生物等效性試驗(yàn)中的重要地位。因此，我們根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)指導(dǎo)原則，并盡可能結(jié)合我們的實(shí)際工作，針對(duì)生物等效性試驗(yàn)中生物分析的分析物確定及分析工作開(kāi)展的注意事項(xiàng)等關(guān)鍵問(wèn)題，談?wù)勎覀兊囊恍┱J(rèn)識(shí)和做法。

 

生物等效性試驗(yàn)生物分析的分析物確定

 

有別于一般的藥動(dòng)學(xué)研究，生物等效性試驗(yàn)的生物分析，確定分析物的原則是：該分析物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)應(yīng)足以反映制劑間吸收速度和吸收程度的差異。這些參數(shù)包括常見(jiàn)的藥物濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC包括AUC0-t、AUC0-∞ 、AUCss部分曲線下面積AUCpantial)、峰濃度(pmax)、達(dá)峰時(shí)間(tmax)，也有一些仍在探討中的參數(shù)，比如Pmax/AUC、平均駐留時(shí)間(MRT)、控釋制劑平臺(tái)時(shí)間(t75%max血藥濃度維持在最大濃度75％以上的時(shí)間)等。根據(jù)這一原則，我們從以下三個(gè)方面進(jìn)行探討。

 

1母藥和代謝物

 

1.1測(cè)定母藥

 

由于母藥的JD比代謝物的JD一更能反映制劑間吸收速度的差異，因此無(wú)論母藥有無(wú)活性，在生物分析技術(shù)條件允許的情況下，通常應(yīng)測(cè)定母藥。

 

氯吡格雷作為前體藥物，其本身并無(wú)活性，在體內(nèi)約85％的氯吡格雷形成無(wú)活性的羧酸代謝物氯吡格雷酸，少部分形成不穩(wěn)定的中間活性代謝物(硫醇代謝物)抑制血小板的聚集，而血漿中氯吡格雷的濃度很低，在生物分析技術(shù)條件不足的時(shí)期不易被檢測(cè)。活性代謝物在血漿中的濃度也較低．且穩(wěn)定性很差．常規(guī)分析方法難以對(duì)其準(zhǔn)確測(cè)定．在樣本采集同時(shí)進(jìn)行衍生化雖可解決穩(wěn)定性的問(wèn)題，對(duì)活性代謝物的專利保護(hù)導(dǎo)致其商業(yè)化對(duì)照品的缺乏，也制約了該分析技術(shù)的應(yīng)用。因此，在早期的氯吡格雷口服制劑生物等效性試驗(yàn)中，大多測(cè)定氯吡格雷酸并以其進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)或增大給藥劑量后測(cè)定氯吡格雷并進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。但隨著分析技術(shù)不斷的發(fā)展．已能準(zhǔn)確可靠地測(cè)定口服氯吡格雷后血漿中母藥氯吡格雷的濃度，在生物等效性試驗(yàn)時(shí)則應(yīng)測(cè)定母藥氯吡格雷棚。當(dāng)然，當(dāng)分析技術(shù)發(fā)展到可以準(zhǔn)確可靠地測(cè)定口服氯吡格雷后血漿中活性代謝物的濃度．并得以廣泛應(yīng)用時(shí)．也許生物等效性試驗(yàn)的分析物將拓展到其母藥和活性代謝物均應(yīng)測(cè)定。

 

1.2測(cè)定活性代謝物

 

當(dāng)母藥是無(wú)活性的前體藥物，且藥物濃度一時(shí)間曲線由于血藥濃度過(guò)低或消除太快而不完整時(shí)，應(yīng)測(cè)定其活性代謝物。非諾貝特在吸收的同時(shí)被組織和血漿中的酯酶迅速、完全地水解為活性代謝物非諾貝特酸，而在血漿中檢測(cè)不到母藥非諾貝特，因此只能通過(guò)檢測(cè)非諾貝特酸的濃度來(lái)反映非諾貝特吸收的速度和程度。

 

1.3測(cè)定母藥和主要活性代謝物

 

當(dāng)母藥和代謝、物均有活性,尤其是活性代謝物在體內(nèi)的暴露量較大時(shí)，一般應(yīng)測(cè)定母藥和主要活性代謝物，以母藥進(jìn)行生物等效性統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)，以主要活性代謝物進(jìn)一步支持生物等效性評(píng)價(jià)的結(jié)論。對(duì)于代謝物，只需提供其濃度、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，以及AUC和p的幾何均數(shù)、幾何均數(shù)比值(geometricmeanratios，GMRs)。

 

氯雷他定在體內(nèi)的主要活性代謝物是去羧乙氧基氯雷他定(地氯雷他定)，兩者均應(yīng)測(cè)定。人體內(nèi)氯雷他定的消除半衰期(t1/2)約為9h，而地氯雷他定的t1/2約為27h，在生物等效性試驗(yàn)的生物樣本采集點(diǎn)的設(shè)計(jì)方面就需要兩者兼顧。阿托伐他汀在體內(nèi)的主要活性代謝物是鄰羥基阿托伐他汀和對(duì)羥基阿托伐他汀,3個(gè)化合物均應(yīng)測(cè)定。但需要注意的是，F(xiàn)DA建議的生物等效性試驗(yàn)用藥劑量為80mg，而在我國(guó)的常用起始劑量為10mg，即便試驗(yàn)采用20mg的給藥劑量，體內(nèi)對(duì)羥基阿托伐他汀的濃度也很低，可能不易測(cè)定，因此目前已報(bào)道的阿托伐他汀鈣的生物等效性試驗(yàn)大多只測(cè)定了阿托伐他汀和鄰羥基阿托伐他汀。

 

阿苯達(dá)唑在體內(nèi)首先代謝成活性代謝物阿苯達(dá)唑亞砜(代謝率高達(dá)98％以上)，最終代謝成無(wú)活性的阿苯達(dá)唑砜。生物等效性試驗(yàn)應(yīng)測(cè)定阿苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑亞砜。特殊的是．首選母藥進(jìn)行生物等效性統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)。但如果確實(shí)有實(shí)驗(yàn)來(lái)證明母藥不能被準(zhǔn)確、精密的測(cè)定時(shí)，則可以選擇活性代謝物阿苯達(dá)唑亞砜進(jìn)行生物等效性統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)。

 

2手性藥物——消旋體和對(duì)映體

 

對(duì)于手性藥物的生物等效性試驗(yàn)，我們應(yīng)考慮測(cè)定消旋體還是對(duì)映體，或者說(shuō)是選擇非手性的分析方法還是手性的分析方法。

 

EMA一般可接受非手性方法．但在以下情況時(shí)應(yīng)采用手性方法：

 

(1)若兩個(gè)對(duì)映體具有不同的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)、明顯不同的藥效學(xué)性質(zhì)、且系統(tǒng)暴露比值受吸收速度的差異所影響．應(yīng)采用手性方法測(cè)定所有對(duì)映體單體，當(dāng)上述對(duì)映體的性質(zhì)未知時(shí)也應(yīng)采用手性方法；

(2)若一個(gè)對(duì)映體有活性，而另一個(gè)對(duì)映體無(wú)活性或活性較低，采用手性方法測(cè)定，且只需要以活性對(duì)映體進(jìn)行生物等效性統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)。

 

FDA認(rèn)為對(duì)于生物利用度試驗(yàn)．有必要測(cè)定對(duì)映體單體。而對(duì)于生物等效性試驗(yàn)一般推薦用非手性方法測(cè)定消旋體。但若兩個(gè)對(duì)映體具有不同的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)性質(zhì)．體內(nèi)暴露較低的對(duì)映體對(duì)療效和安全性起決定性作用，且至少一個(gè)對(duì)映體具有非線性吸收性質(zhì)(表現(xiàn)為對(duì)映體在體內(nèi)的濃度比值隨吸收速度的變化而變化)時(shí)，應(yīng)采用手性方法，并分別以對(duì)映體單體進(jìn)行生物等效性統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)。

 

非甾體抗炎藥布洛芬是一個(gè)手性藥物．其右旋布洛芬(S-對(duì)映體)和旋布洛芬(R-對(duì)映體)具有不同的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)性質(zhì)，且對(duì)映體在體內(nèi)的濃度比值受吸收速度的影響。TORRADO等進(jìn)行了布洛芬混懸劑的生物等效性試驗(yàn)，分別采用非手性方法和手性方法測(cè)定了布洛芬消旋體和布洛芬的兩個(gè)對(duì)映體單體，并進(jìn)行了生物等效性評(píng)價(jià)，結(jié)果列于表1。依據(jù)FDA指導(dǎo)原則中規(guī)定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)采用非手性方法測(cè)定布洛芬消旋體時(shí)，結(jié)論是受試制劑和參比制劑生物等效：然而，采用手性方法測(cè)定布洛芬對(duì)映體時(shí)，結(jié)論是對(duì)于有效的一對(duì)映體，不能判斷兩制劑生物等效。受試制劑的生物利用偏低；對(duì)于無(wú)效的、有副作用的一對(duì)映體，不能判斷兩制劑生物不等效，受試制劑的生物利用度偏高；但是將兩個(gè)對(duì)映體加起來(lái)，結(jié)論又是兩制劑生物等效?？梢钥闯觯捎梅鞘中苑椒ê褪中苑椒赡軙?huì)得到截然不同的評(píng)價(jià)結(jié)果，應(yīng)慎重選擇非手性方法代替手性方法。

 

 

結(jié)合我們完成的一些手性藥物制劑生物等效性試驗(yàn)的生物分析工作，我們認(rèn)為：

 

(1)嚴(yán)格來(lái)講，手性化合物的對(duì)映體本質(zhì)上是不同的化合物，雖然它們除旋光性不同，其他物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)均相同，但多數(shù)具有不同的生理活性．因此手性藥物的生物分析理應(yīng)采用手性方法。

(2)在不增加生物等效性試驗(yàn)結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)的前提下，某些情況還是可以用非手性方法代替手性方法的．最主要的兩種情況是：

①對(duì)映體在吸收方面無(wú)立體選擇性，即在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、首關(guān)效應(yīng)無(wú)立體選擇性；

②無(wú)活性或活性較低的對(duì)映體在體內(nèi)暴露量較小。

 

3多組分藥品

 

針對(duì)多組分藥品的生物等效性試驗(yàn)分析物的確定．FDA指出應(yīng)該測(cè)定足以反映吸收速度和吸收程度的標(biāo)志化合物,應(yīng)綜合考慮：各組分在制劑中含量的多少、在體內(nèi)濃度的高低、以及生物活性的大小。對(duì)于不同的多組分藥品，應(yīng)具體情況具體分析。目前，我國(guó)對(duì)于西藥復(fù)方制劑的要求是各組分均應(yīng)測(cè)定。需要強(qiáng)調(diào)的是，多組分藥品生物等效性試驗(yàn)分析物確定時(shí)仍需要考慮“1.1母藥和代謝物”、“1.2手性藥物——消旋體和對(duì)映體”中提及的問(wèn)題。另外，在進(jìn)行復(fù)方制劑生物等效性試驗(yàn)的生物分析時(shí)，還需要關(guān)注并考察各分析物的測(cè)定是否會(huì)受到其他分析物(共存組分)的影響。

 

苯磺酸氨氯地平／阿托伐他汀鈣片有效成分為苯磺酸氨氯地平和阿托伐他汀鈣，根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則和要求．進(jìn)行生物等效性試驗(yàn)時(shí)兩個(gè)成分均應(yīng)測(cè)定，且均應(yīng)進(jìn)行生物等效性統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)，還需要測(cè)定阿托伐他汀的主要活性代謝物鄰羥基阿托伐他汀和對(duì)羥基阿托伐他汀，并提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持生物等效性評(píng)價(jià)的結(jié)論。

 

復(fù)方氨酚烷胺口服制劑有效藥物成分為對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺、咖啡因、馬來(lái)酸氯苯那敏和人工牛黃。其中，人工牛黃是由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成的，其中膽酸和膽紅素為主要成分，中國(guó)藥典規(guī)定人工牛黃中膽酸和膽紅素含量分別不得少于13．0％和0．63％。目前尚無(wú)天然牛黃或人工牛黃在人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究的報(bào)道。在我們完成的一項(xiàng)復(fù)方氨酚烷胺口服制劑的生物等效性試驗(yàn)中。受試制劑和參比制劑中人工牛黃的用藥劑量均為12mg,若以膽酸和膽紅素含量分別為13.O％和0.63％計(jì)算，則含膽酸1.56mg、膽紅素75.6ug。膽紅素的用藥量很小，即使口服后完全被吸收，也不足以影響受試者體內(nèi)膽紅素的正常水平，而對(duì)受試者用藥前后血漿中膽酸濃度的測(cè)定結(jié)果也表明人體內(nèi)內(nèi)源性膽酸的濃度較高，且個(gè)體內(nèi)濃度水平相對(duì)較穩(wěn)定。用藥前后受試者體內(nèi)的膽酸濃度無(wú)明顯改變．但個(gè)體間差異較大。因此，我們參考了FDA關(guān)于多組分藥品的生物等效性試驗(yàn)分析物的確定原則，測(cè)定了對(duì)乙酰氨基酚、金剛烷胺、咖啡因、氯苯那敏的血藥濃度并以其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行了生物等效性評(píng)價(jià)。而未將人工牛黃主要成分膽酸和膽紅素作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)?；蛟S可以參考FDA的這個(gè)原則進(jìn)行我國(guó)中成藥的生物等效性研究，提高我國(guó)對(duì)中藥的監(jiān)管水平，以確保中藥的質(zhì)量。

 

生物等效性試驗(yàn)生物分析中的注意事項(xiàng)

 

分析測(cè)定應(yīng)在一個(gè)合適的范圍內(nèi)準(zhǔn)確、精密地測(cè)定未知生物樣本。由于生物等效性試驗(yàn)的特殊性，生物分析的結(jié)果可能會(huì)對(duì)生物等效性試驗(yàn)中方差分析的誤差來(lái)源及誤差大小產(chǎn)生影響。針對(duì)這一問(wèn)題，我們根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則。結(jié)合我們的工作，從以下幾個(gè)方面談?wù)勆锏刃栽囼?yàn)中生物分析時(shí)需關(guān)注的內(nèi)容。

 

1分析批

 

EMA和FDA關(guān)于分析批的內(nèi)容、合格標(biāo)準(zhǔn)在細(xì)節(jié)上雖略有不同，但在原則上基本一致。

 

兩者均要求在方法確證之后方可進(jìn)行未知生物樣本的分析測(cè)定，一個(gè)完整的分析批至少應(yīng)包括：用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白樣本、零點(diǎn)(zero)樣本(空白樣本添加工作濃度的內(nèi)標(biāo))、標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知生物樣本．以及隨行的均勻分布在未知生物樣本測(cè)定過(guò)程中的、數(shù)量不低于該分析批未知生物樣本總數(shù)5％、至少3個(gè)濃度水平且每一濃度水平至少2樣本的質(zhì)量控制(Qc)樣本。而FDA還指出應(yīng)在分析批之前進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性(systemsuitability)的考察。

 

兩者均要求至少3／4的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的測(cè)定濃度與理論濃度之間相對(duì)誤差(RE)不應(yīng)超出±15％的范圍，定量下限(LLOQ)可放寬至±20％，且合格的濃度點(diǎn)總數(shù)應(yīng)不少于6個(gè)，采用合格的濃度點(diǎn)進(jìn)行線性回歸分析．線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r應(yīng)大于0.99。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果不符合上述要求時(shí)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線作廢。不可用于當(dāng)批未知生物樣本的分析測(cè)定，應(yīng)重新建立可滿足要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，EMA還指出若LLOQ樣本不合格，則以合格的最低濃度點(diǎn)作為L(zhǎng)LOQ，若定量上限(ULOQ)樣本不合格，則以合格的最高濃度點(diǎn)作為ULOQ，修正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍應(yīng)能覆蓋全部的QC濃度水平．若同一分析批建立2條標(biāo)準(zhǔn)曲線、且僅1個(gè)LLOQ或ULOQ樣本不合格，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍不需要修正。

 

EMA要求至少2／3、且同一濃度水平至少1／2的QC樣本的測(cè)定濃度與理論濃度的RE應(yīng)不超過(guò)±15％，LLOQ濃度點(diǎn)可放寬至±20％，F(xiàn)DA的要求基本相同，不同的是不合格的Qc樣本不能全部出現(xiàn)在同一濃度水平中。QC樣本測(cè)定結(jié)果不符合上述要求時(shí)，該分析批未知生物樣本的測(cè)試結(jié)果作廢，需要重新處理并測(cè)定。此外，兩者也均要求除考察每個(gè)分析批的QC樣本的準(zhǔn)確度與精密度之外．還應(yīng)考察所有可接受分析批各濃度水平的QC樣本的總體準(zhǔn)確度與精密度，計(jì)算時(shí)應(yīng)包括這些分析批中不合格的QC樣本。合格標(biāo)準(zhǔn)仍然是RE不超過(guò)±15％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不超過(guò)15％。EMA還特別強(qiáng)調(diào)Qc樣本的總體準(zhǔn)確度與精密度不符合要求時(shí)。應(yīng)另外進(jìn)行考察來(lái)解釋導(dǎo)致這種偏離的原因，而對(duì)于生物等效性試驗(yàn)，Qc樣本的總體準(zhǔn)確度與精密度不符合要求很可能會(huì)導(dǎo)致整體數(shù)據(jù)作廢。

 

我們一直關(guān)注并依循EMA和FDA指導(dǎo)原則的最新要求進(jìn)行生物分析。但結(jié)合我們?cè)谏锏刃栽囼?yàn)中生物分析的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)某些細(xì)節(jié)的要求，尤其是它們的不同之處，有一些自己的認(rèn)識(shí)：

 

(1)關(guān)于系統(tǒng)適應(yīng)性的考察，我們遵循FDA的原則，在分析批開(kāi)始之前．應(yīng)至少重復(fù)6次進(jìn)樣測(cè)定同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣本(所含溶劑、生物基質(zhì)等最好與分析批中所測(cè)樣本一致)，計(jì)算相關(guān)分析物及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的RSD,RSD不超過(guò)15％(標(biāo)準(zhǔn)樣本為生物樣本處理所得時(shí))可證明儀器運(yùn)行狀態(tài)適合該分析批樣本的測(cè)定，如RSD不合格，則應(yīng)采取適當(dāng)措施改良儀器運(yùn)行狀態(tài)使其適合樣本的測(cè)定。

 

(2)考慮到消除相濃度逐漸接近LLOQ或大于LLOQ的那一個(gè)最低濃度點(diǎn)，若LLOQ不合格而以滿足要求的最低濃度點(diǎn)作為L(zhǎng)LOQ，則很可能導(dǎo)致消除相原本可測(cè)定的濃度點(diǎn)嚴(yán)重缺失，并影響t1/2、AU/0-∞等參數(shù)的計(jì)算以及生物等效性評(píng)價(jià)的結(jié)果，而EMA也提出在某分析批LLOQ不合格而導(dǎo)致某些樣本濃度不可測(cè)時(shí)，還需要在LLOQ合格的分析批中復(fù)測(cè)這些樣本；另外，ULOQ作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)。其RE與低濃度點(diǎn)相比理應(yīng)較小，方法建立及驗(yàn)證時(shí)未出現(xiàn)由于儀器響應(yīng)超載

(overload)而導(dǎo)致的ULOQ不合格，卻在未知生物樣本測(cè)定時(shí)出現(xiàn)ULOQ不合格的現(xiàn)象。則很可能是與其他一些錯(cuò)誤操作有關(guān)。因此我們認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的LLOQ和ULOQ必須滿足要求，不滿足要求時(shí)不可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍進(jìn)行修正，該標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)按作廢處理，采取適當(dāng)措施尋找原因加以避免，并重新建立可滿足要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

(3)考慮到生物等效性試驗(yàn)每個(gè)分析批測(cè)定的樣本量可能較大．尤其是在方法通量高的情況下，分析批中的QC樣本總數(shù)可能較大，我們認(rèn)為現(xiàn)有原則關(guān)于同一濃度水平最多允許不合格QC樣本數(shù)量的要求都略有不妥。若根據(jù)FDA的要求，可能會(huì)出現(xiàn)不合格QC樣本的總體數(shù)量增加但分析批卻反而從不合格變?yōu)楹细竦那闆r，可見(jiàn)FDA的要求不甚合理，而我國(guó)CFDA要求不合格的Qc樣本“不能出現(xiàn)在同一濃度質(zhì)控樣品中”又過(guò)于嚴(yán)苛，相比之下EMA的要求更為合理．但也略微寬松,允許同一濃度水平中出現(xiàn)較多不合格的0C樣本可能會(huì)導(dǎo)致位于該濃度水平附近的未知生物樣本的測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此．我們采用的標(biāo)準(zhǔn)是：同一濃度水平至多允許1／3的QC樣本的測(cè)定結(jié)果不合格。

 

上述要求是確保準(zhǔn)確、精密測(cè)定未知生物樣本的最基本的要求，應(yīng)嚴(yán)格地遵循以確保生物等效性試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果的質(zhì)量。

 

2處理批

 

由于生物等效性試驗(yàn)每個(gè)分析批的生物樣本量較大，通常我們無(wú)法同時(shí)處理一個(gè)分析批所有受試者的樣本，而需要分批處理。為了減少分析測(cè)定引起的不必要的個(gè)體內(nèi)差異。同一名受試者的所有未知生物樣本應(yīng)同時(shí)處理．并隨行處理低、中、高濃度的QC樣本。當(dāng)然，如果樣本中分析物的穩(wěn)定性比較差，則需要綜合考慮分析物可穩(wěn)定的時(shí)長(zhǎng)、試驗(yàn)的周期數(shù)及清洗期時(shí)長(zhǎng)、樣本分析測(cè)定所需時(shí)長(zhǎng)等因素，安排分析批和處理批。

 

3盲測(cè)

 

為避免主觀意識(shí)對(duì)分析測(cè)定結(jié)果的影響，EMA要求生物分析應(yīng)處于盲測(cè)的狀態(tài)。結(jié)合我國(guó)開(kāi)展生物等效性試驗(yàn)的一些現(xiàn)狀，我們認(rèn)為盲測(cè)是很有必要的。從事生物等效性試驗(yàn)生物分析的人員不僅不應(yīng)知道所測(cè)樣本是受試者服用受試制劑(testformulation，T)還是參比制劑(referenceformulation，R)之后所采集的，甚至連分組情況也不應(yīng)知道。完成分析測(cè)定之后，在分析測(cè)定報(bào)告中只需要列出所測(cè)樣本的編號(hào)及對(duì)應(yīng)的測(cè)定濃度，分析測(cè)定工作完成、數(shù)據(jù)核對(duì)、鎖定之后方可揭盲。

 

4復(fù)測(cè)

 

在生物分析的過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)某分析批首次測(cè)定數(shù)據(jù)作廢，儀器進(jìn)樣、操作的失誤，測(cè)定濃度超過(guò)ULOQ、色譜行為差、內(nèi)標(biāo)響應(yīng)異常等情況。而需要復(fù)測(cè)。復(fù)測(cè)包括重新進(jìn)樣(reinjection)、重新處理再測(cè)定(reprocessingandreanalysis)。EMA和FDA均要求無(wú)論因何原因進(jìn)行何種復(fù)測(cè)，在未知生物樣本分析測(cè)定工作開(kāi)始之前，就應(yīng)該在試驗(yàn)方案、或研究計(jì)劃、或相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(standardoperatingprocedures，SOPs)中規(guī)定復(fù)測(cè)的理由、復(fù)測(cè)的方法、以及測(cè)定值的取舍標(biāo)準(zhǔn)，在報(bào)告中也應(yīng)提供原始測(cè)定值、復(fù)測(cè)的理由、復(fù)測(cè)值、最終接受值、接受的標(biāo)準(zhǔn)、以及復(fù)測(cè)樣本量占總樣本量的比例。但在復(fù)測(cè)的理由上．EMA和FDA可接受的情況略有不同，我們認(rèn)為：

 

(1)樣本處理后的樣液體積足以重新進(jìn)樣,且方法確證已證明重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性良好、分析物于處理后在進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性良好，由于

儀器原因?qū)е逻M(jìn)樣失敗或者個(gè)別樣本在進(jìn)樣后色譜行為差(如峰形差、保留時(shí)間改變)時(shí)，才可以通過(guò)重新進(jìn)樣來(lái)復(fù)測(cè)樣本。

 

(2)在以下情況時(shí)，需要重新處理再測(cè)定——重新進(jìn)樣結(jié)果仍然異常；由于儀器原因?qū)е逻M(jìn)樣失敗(包括單個(gè)的樣本、以及整批未能繼續(xù)進(jìn)樣的樣本)或者個(gè)別樣本在進(jìn)樣后色譜行為差，但樣液體積不足以重新進(jìn)樣，或可重新進(jìn)樣的時(shí)間已超出分析物于處理后在進(jìn)樣器中的穩(wěn)定時(shí)長(zhǎng)；由于QC樣本不滿足要求導(dǎo)致整個(gè)分析批作廢；測(cè)定濃度高于ULOQ；內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值明顯高于或低于當(dāng)前分析批標(biāo)準(zhǔn)樣本(標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本及QC樣本)內(nèi)標(biāo)平均響應(yīng)值，但需要事先量化這種“內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值異常”：在用藥前采集的樣本中檢測(cè)到分析物響應(yīng)值高于LLOQ，但需要結(jié)合合理的測(cè)定誤差范圍和分析物性質(zhì)進(jìn)行判斷，如是否為內(nèi)源性物質(zhì)。

 

(3)對(duì)于生物等效性試驗(yàn)而言，一般不允許因出現(xiàn)不符合藥動(dòng)學(xué)趨勢(shì)的高濃度值或低濃度值而復(fù)測(cè)，因?yàn)檫@樣的復(fù)測(cè)很可能會(huì)導(dǎo)致生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果的偏倚。即便復(fù)測(cè)，也僅是為了探索導(dǎo)致異常的原因．以避免類似的問(wèn)題再次發(fā)生。

 

5已測(cè)樣本再分析(incurredsamplesreanalysis．ISR)

 

由于在方法驗(yàn)證時(shí)使用的標(biāo)準(zhǔn)樣本和QC樣本可能無(wú)法模擬試驗(yàn)采集到的實(shí)際生物樣本。例如，蛋白結(jié)合、已知和未知代謝物的逆向轉(zhuǎn)化、樣本均一性、合并用藥所引起的差異．可能導(dǎo)致實(shí)際樣本在保存和處理過(guò)程中分析物濃度的變化，而使測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度受到影響。因此，應(yīng)考慮通過(guò)ISR．即在一定時(shí)間周期內(nèi)重新分析已測(cè)的生物樣本。來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)際生物樣本測(cè)定結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠、可重現(xiàn)。

 

FDA并無(wú)關(guān)于ISR的要求，但EMA要求所有關(guān)鍵的生物等效性試驗(yàn)的生物分析均需要進(jìn)行ISR，并提供了詳細(xì)的操作要求及合格標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)定的未知生物樣本總數(shù)少于1000時(shí)應(yīng)對(duì)1O％的樣本進(jìn)行ISR，測(cè)定的未知生物樣本總數(shù)超過(guò)1000時(shí)應(yīng)對(duì)5％的樣本進(jìn)行ISR；應(yīng)選擇接近丁pmax以及在消除相的樣本：兩次測(cè)定濃度值的差異應(yīng)不超過(guò)20％，且至少67％的ISR樣本的測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合此要求。

 

我們認(rèn)為，鑒于ISR的主要目的是評(píng)價(jià)實(shí)際樣本分析測(cè)定結(jié)果的是否準(zhǔn)確可靠、可重現(xiàn)，其反映的是一系列因素的綜合結(jié)果，這其中包括分析方法、儀器狀態(tài)、樣本的采集、保存、處理等各方面的因素，因此即便是采用相同的分析方法測(cè)定相同的分析物。只要是不同的試驗(yàn)(不屬于同一次樣本采集、同一次生物分析)，每個(gè)生物等效性試驗(yàn)的生物分析都應(yīng)該進(jìn)行ISR；ISR應(yīng)盡早進(jìn)行，且在分析物的穩(wěn)定時(shí)長(zhǎng)內(nèi)完成；樣本總數(shù)為1000時(shí)應(yīng)對(duì)l0％的樣本(100個(gè))進(jìn)行ISR，樣本總數(shù)超過(guò)1000時(shí)應(yīng)對(duì)5％的樣本進(jìn)行ISR，并且ISR的樣本量應(yīng)不少于樣本總數(shù)為1000時(shí)ISR的樣本量(100個(gè))，也就是說(shuō)樣本總數(shù)為1000～2000時(shí)，ISR的樣本量為100個(gè)；ISR樣本的選擇除了應(yīng)選擇不同受試者的接近于pmax以及在消除相的樣本外，還需注意不應(yīng)選擇超過(guò)ULOQ、已經(jīng)復(fù)測(cè)或需要復(fù)測(cè)的樣本。

 

結(jié)語(yǔ)

 

目前我國(guó)生物等效性試驗(yàn)生物分析的現(xiàn)狀迫切需要規(guī)范化。因此我們根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)指導(dǎo)原則．在總結(jié)實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探討了生物等效性試驗(yàn)中生物分析需注意的關(guān)鍵問(wèn)題，希望能對(duì)其規(guī)范化提供可參考的價(jià)值。同時(shí)，我們也期待有關(guān)指導(dǎo)原則的早日出臺(tái)，這將有利于提高我國(guó)生物等效性試驗(yàn)的質(zhì)量，提高我國(guó)藥品研發(fā)的水平。