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骨肽類制劑是以新鮮或冷凍的豬、鹿或胎牛骨經(jīng)生物技術(shù)提取制成的滅菌水溶液，其內(nèi)含有多種多肽類骨代謝活性因子、有機(jī)鈣、磷、無機(jī)鹽、氨基酸及微量元素等，是一種具有生物活性的多組分生化藥。其藥理作用有刺激成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)新骨形成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，增加骨鈣沉淀及抗炎、鎮(zhèn)痛等。臨床上主要用于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)增生性疾病、骨折及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等治療。

1 骨肽類制劑質(zhì)量控制現(xiàn)狀

骨肽類制劑在各國藥典均未收載，我國相關(guān)品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國家標(biāo)準(zhǔn)地升部十六冊，詳見表 1?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)控指標(biāo)包括：1）鑒別：雙縮脲顯色、茚三酮顯色、UV、HPLC及特征圖譜；2）檢查：包括pH、蛋白質(zhì)、異常毒性、熱原、過敏試驗(yàn)、降壓物質(zhì)等項(xiàng)目；3）含量測定：雙縮脲法或福林酚法對多肽含量進(jìn)行控制等。

表 1 已有骨肽類制劑（部分）國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

含量測定中所采用的雙縮脲法或福林酚法，對于含有肽鍵的動、植物中的任何多肽均可產(chǎn)生正反應(yīng)，專屬性差[3]。因此，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在含量測定的基礎(chǔ)上，采用生物活性測定方法，通過生物反應(yīng)的強(qiáng)度可較直觀地反映藥物總體活性或效價(jià)，與理化分析方法相結(jié)合，達(dá)到全面綜合地保證藥品的安全性、有效性和質(zhì)量可控的目的。

2 骨肽類制劑研究現(xiàn)狀

生物活性測定法是利用藥物對整體動物、離體器官、組織或細(xì)胞等生物體上某些特定指標(biāo)的反應(yīng)強(qiáng)度來測定藥物有效性，它是以藥物的藥理作用及藥效學(xué)試驗(yàn)為研究基礎(chǔ)。臨床上骨肽類藥物用于治療骨質(zhì)疏松癥及修復(fù)骨折，主要是基于刺激成骨細(xì)胞增值及促進(jìn)新骨形成的藥理作用；而用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎則是基于其抗炎的藥理作用。

2.1 對成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的作用

骨重建平衡表現(xiàn)為成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收之間的平衡，大多骨類疾病均與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡失調(diào)有關(guān)，包括骨質(zhì)疏松癥和骨折。骨重建過程包括破骨細(xì)胞貼附在舊骨區(qū)域，分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩；其后，成骨細(xì)胞移行至被吸收部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨。

成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，在骨骼形成、損傷后再生的過程中起決定性作用，常用于骨代謝研究的成骨細(xì)胞模型包括：1）人骨肉瘤細(xì)胞株MG63；2）大鼠骨肉瘤細(xì)胞的成骨樣細(xì)胞UMR106；3）從C57BL/6小鼠顱頂細(xì)胞中建立的前成骨細(xì)胞株MC3T3-E1-subclone14。目前，大量文獻(xiàn)表明骨肽類制劑對成骨細(xì)胞有明顯促增值作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨代謝。岳云飛等采用四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法研究建立了注射用鹿瓜多肽促進(jìn)MG63細(xì)胞增值的體外細(xì)胞生物活性測定方法。王燦等采用Cell Counting Kit（CCK-8）法研究表明鹿瓜多肽注射液對UMR106細(xì)胞及MC3T3-E1細(xì)胞株均有促進(jìn)增殖作用，且對UMR106細(xì)胞株促增殖作用更為明顯，并建立相應(yīng)體外活性評價(jià)方法。

破骨細(xì)胞是骨吸收的功能細(xì)胞，其功能亢進(jìn)在骨質(zhì)疏松中具有重要的意義。陳雷等通過鹿瓜多肽注射液對小鼠顱骨骨溶解抑制作用實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色在藥物干預(yù)組中破骨細(xì)胞數(shù)目較陰性對照組減少，表明鹿瓜多肽注射液可減少破骨細(xì)胞數(shù)目。唐瑛等通過骨肽注射液作用于去卵巢大鼠試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)骨肽治療組破骨細(xì)胞上Fas抗原表達(dá)增加，與配體結(jié)合而引起細(xì)胞凋亡，表明骨肽注射液可通過調(diào)控Fas蛋白誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，而達(dá)到抑制破骨細(xì)胞骨吸收作用，提示骨肽類制劑作用于破骨細(xì)胞骨吸收是其發(fā)揮藥效的另一作用機(jī)制。

2.2 治療骨質(zhì)疏松癥作用

有大量的臨床研究表明骨肽類藥物治療骨質(zhì)疏松癥有顯著療效。賈文等通過臨床穴位注射骨肽注射液治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者，結(jié)果顯示治療組患者骨密度較對照組鈣劑治療有明顯改善，表明骨肽注射液對治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有較好療效。還有文獻(xiàn)顯示骨肽類藥物與阿倫磷酸鈉、降鈣素等一些臨床常用骨質(zhì)疏松癥藥物聯(lián)合用藥，在改善臨床癥狀或是增加骨密度方面均優(yōu)于單一用藥。去卵巢雌鼠模型動物是研究絕經(jīng)后雌激素缺乏而引起骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典模型動物。段永宏等通過研究鹿瓜多肽注射液對去卵巢大鼠骨組織力學(xué)的影響，結(jié)果顯示鹿瓜多肽注射液給藥組的骨密度較陰性對照組顯著增加，骨小梁間隔變小，骨皮質(zhì)增厚，與正常對照組接近，表明鹿瓜多肽對去卵巢大鼠的骨密度及骨形態(tài)結(jié)構(gòu)有較好維持作用。

2.3 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化作用

機(jī)體骨折后修復(fù)過程需要局部聚集數(shù)量足夠的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨，其過程類似于胚胎期骨形成。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是具有高自我更新能力的多向分化潛能干細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，是科學(xué)研究骨組織工程的理想種子細(xì)胞。MSCs誘導(dǎo)分化過程中的各種骨代謝因子起重要作用，骨肽類制劑中含有多種骨誘導(dǎo)活性因子，包括β-轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）等。TGF-β是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的超家族，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成及成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原蛋白。BMPs亦屬于TGF-β超家族，是間充質(zhì)干細(xì)胞向骨系細(xì)胞分化的最初信號分子，誘導(dǎo)分化軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞而促進(jìn)新骨形成。王偉剛等采用ELISA法檢測骨肽作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）后TGF-β1的表達(dá)，研究表明給藥組中TGF-β1蛋白含量較對照組有明顯增強(qiáng)。

骨形成初期成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而后進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)成熟階段，成骨細(xì)胞分泌的堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是成骨細(xì)胞分化的主要早期特異性指標(biāo)。Ⅰ型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，作為依托和骨架使骨鈣素和羥基磷灰石可與其結(jié)合并沉淀，是成骨細(xì)胞分化中期指標(biāo)。骨鈣素（Osteocalcin，OCN）是由成骨細(xì)胞分泌的一種非膠原性蛋白，在成骨分化晚期能夠促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成，是成骨細(xì)胞完全分化成熟的指標(biāo)。段智霞等用自行合成的BMP-2誘導(dǎo)MSCs體外定向成骨，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物ALP、Ⅰ型膠原、OCN mRNA的表達(dá)均明顯增加，表明BMP-2能有效促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化。

2.4 抗炎作用

一些文獻(xiàn)顯示骨肽類制劑可協(xié)助巨噬細(xì)胞參與組織修復(fù)而發(fā)揮抗炎作用。劉靜等在風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)治療上加用骨瓜提取物以探討研究其抗炎作用，結(jié)果顯示臨床總抗炎效率明顯提高，治療效果顯著。侯曉怡等利用大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎動物模型研究鹿瓜多肽注射液的抗炎作用，結(jié)果顯示給藥組可有效降低血清中TNF-α及IL-6含量，表明鹿瓜多肽注射液可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，減少炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生而起到良好抗炎作用。歐陽杰湖等參照生物活性檢定實(shí)驗(yàn)方法，建立巴豆油致小白鼠耳廓腫脹經(jīng)典體外抗炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠碓u價(jià)骨瓜提取物注射液抗炎的生物活性。周密妹等研究顯示骨多肽本身并無抗炎作用，而是制劑中加入的全蝎或甜瓜籽提取物能夠降低局部毛細(xì)血管通透性而改善血液流變性，減少炎性滲出，而緩解炎癥反應(yīng)的破壞性。

3 討論

近年來，骨肽類藥物的主要藥效學(xué)及臨床效用已逐漸被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但質(zhì)量可控性不夠仍制約著骨肽類藥物的應(yīng)用和發(fā)展。生物活性測定是生物制品或生化藥品質(zhì)量分析的常用方法，可準(zhǔn)確地測定產(chǎn)品的生物學(xué)效價(jià)并評價(jià)其穩(wěn)定性，反映產(chǎn)品批與批之間的一致性，近年來成為骨肽類藥物質(zhì)量控制的研究熱點(diǎn)。

生物活性測定法以藥物的藥理作用及藥效學(xué)為研究基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，并運(yùn)用特定的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，反映藥物有效性及臨床功能，可分為效價(jià)測定法（定量法）和活性限制測定法（半定量法）。其內(nèi)容包括：測定整體動物或特定器官對藥物的生物學(xué)反應(yīng)、測定細(xì)胞水平的生化或生理學(xué)反應(yīng)、免疫學(xué)作用下的酶反應(yīng)速率以及配體或受體結(jié)合反應(yīng)等。生物活性是表示藥物產(chǎn)生特定生物學(xué)效應(yīng)的能力，尋找包括整體動物、組織、細(xì)胞等生物標(biāo)記物上的反應(yīng)強(qiáng)度及劑量作為生物活性測定方法學(xué)和限值研究的依據(jù)。生物活性指標(biāo)的選擇應(yīng)考慮藥品本身功能主治，在以現(xiàn)代藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上選擇專屬性強(qiáng)且靈敏度高的作為生物活性測定指標(biāo)。

由于生物制品的復(fù)雜性且影響生物活性測定的各種變異因素較多，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中在每次僅改變一個(gè)變量，調(diào)整該變量的變化幅度，以分別確定每個(gè)變量的影響程度。在眾多因素中找出一些影響因素較大的，將影響因素及其變化幅度進(jìn)行組合，以確定影響因素和反應(yīng)程度之間的相互作用，進(jìn)而優(yōu)化穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)操作條件，并通過觀察小幅度的改變影響因素對活性檢測的結(jié)果測定方法的耐用性，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證及生物統(tǒng)計(jì)分析的比較，制定出可接受的誤差范圍，從而開發(fā)建立出合理、可行、可控的生物活性測定方法。

根據(jù)骨肽類藥物刺激成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)新骨形成，防治骨質(zhì)疏松及抗炎等多種生物學(xué)活性，我們初步探索建立評價(jià)骨肽類藥物生物活性的體內(nèi)巴豆油致小鼠耳廓腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)以及體外促成骨細(xì)胞增值細(xì)胞試驗(yàn)，為其生物活性測定方法的開發(fā)打開思路。建立關(guān)聯(lián)骨肽類制劑臨床藥理藥效的生物活性測定方法，與理化分析方法相結(jié)合的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對骨肽類制劑進(jìn)行評價(jià)，可以更好地反映藥品特征全貌，以期達(dá)到更全面完善地控制該類藥品的安全性和有效性。