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磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑是一類抑制磷酸二酯酶活性的藥物，被用于治療男性勃起功能障礙等疾病。由于其特殊的功能主治和市場需求，在抗疲勞類保健品中添加PDE-5抑制劑成為不法廠商謀取暴利的手段，其中以添加西地那非、他達拉非和伐地那非等PDE-5抑制劑最為常見。為此，2009年原國家食品藥品監(jiān)督管理總局陸續(xù)頒布了用于監(jiān)管中成藥及保健食品中非法添加PDE-5抑制劑的補充檢驗方法，對不法行為起到了有效的震懾。但隨著監(jiān)督查處工作力度的不斷深入，陸續(xù)報道發(fā)現(xiàn)一些現(xiàn)行檢驗標(biāo)準(zhǔn)中未涵蓋的新型PDE-5抑制劑。這些新型PDE-5抑制劑大多是西地那非衍生物，由于國內(nèi)無相關(guān)檢驗標(biāo)準(zhǔn)，可能被檢驗人員忽略，危害消費者健康，進而擾亂保健食品市場秩序。

筆者在宣稱抗疲勞的保健食品中通過“異常色譜法”發(fā)現(xiàn)一種西地那非衍生物，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)以及核磁共振氫譜（1H-NMR）技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進行解析，并結(jié)合國外文獻分析，最終確定該化合物為去甲基卡波地那非（Desmethyl Carbodenafil）。

1 材料

1.1 材料與設(shè)備

甲醇（色譜純，美國迪馬公司），乙腈（色譜純，美國迪馬公司），甲酸（色譜純，天津科密歐公司）；二級純化水；抗疲勞的保健食品來源于抽檢案件；去甲基卡波地那非對照品（純度99.7%，購自加拿大TLC pharmachem公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-MS8050液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；Ultimate3000高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；CheetahHP100制備液相儀（天津博納艾吉爾公司）；Bruker Plus 600核磁共振儀（德國Bruker公司）；MS-204S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 方法

2.1 高效液相色譜方法

參照文獻中高效液相色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 µm），柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min-1；流動相：A為磷酸三乙胺溶液（取三乙胺7 mL，用水稀釋至1000 mL，用磷酸調(diào)pH至2.8）-甲醇-乙腈（60︰20︰20），B為磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（8︰46︰46），梯度洗脫：0~12 min，0%B；12~25 min，100%B；25~30 min，100%B；30~31 min，0%B；31~36 min，0%B；二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm；掃描范圍：200~400 nm。

2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法

參照文獻液質(zhì)聯(lián)用色譜條件。色譜柱: Dikma Spursil C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 µm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脫：0~1 min，10%B；1~4 min，40%B；4~7 min，90%B；7~9 min，90%B；9~9.1 min，10%B；9.1~12 min，10%B；流速：0.3 mL·min-1；進樣量2 µL；柱溫35 ℃。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描模式；多反應(yīng)檢測（MRM）；霧化器流速：3 L·min-1；加熱器溫度：400 ℃；干燥氣流速：10 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；接口溫度：300 ℃；噴霧電壓：4.5 kv。

2.3 分離純化方法

稱取7 g樣品，用125 mL乙腈超聲（功率：250 W頻率：33 Hz）提取20 min，8000 r·min-1離心8 min，0.22 µm尼龍濾膜濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL，加10 mL乙醇超聲（功率：250 W頻率：33 Hz）溶解，加10 mL二甲基亞砜稀釋。采用Venusil MP C18（100 mm×250 mm，5 µm）色譜柱。流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈；梯度洗脫：0~3 min，B 10%；3~43 min，B 10%~50%；波長230 nm下收集主色譜峰，冷凍干燥，即得純化物。

2.4 核磁氫譜方法

稱取5 mg純化樣品，加入氘代氯仿溶解，使用5 mm PABBO探頭，1H觀察頻率為600.23 MHz，進行1H-NMR測試。

2.5 對照品溶液制備

精密稱取對照品8 mg，置25 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 µm有機濾膜濾過，即為HPLC對照品溶液。將對照品溶液稀釋至每1 mL含有100 ng溶液，作為MS對照品溶液。

2.6 供試品溶液制備

精密稱取待測樣品0.1 g，置10 mL容量瓶中，加乙腈8 mL超聲（功率：250 W頻率：33 Hz）15 min，放冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，0.22 µm有機濾膜濾過，即為HPLC供試品溶液。將HPLC供試品溶液用乙腈稀釋至每1 mL含有100 ng溶液，作為MS供試品溶液。

3 結(jié)果與分析3.1 高效液相色譜分析

在樣品的色譜圖中發(fā)現(xiàn)一個色譜峰，保留時間為7.980 min（見圖 1）。在209 nm和295 nm處有最大吸收波長（見圖 2）。與補充檢驗辦法（編號2009030）所列11種非法添加物保留時間及光譜圖均不一致，進一步通過質(zhì)譜分析。

圖 1 樣品色譜圖（A）與去甲基卡波地那非對照品色譜圖（B）

圖 2 樣品（1）和去甲基卡波地那非對照品（2）紫外光譜圖

3.2 質(zhì)譜解析

對樣品進行一級和二級質(zhì)譜全掃描分析（見圖 3）。結(jié)果顯示分子離子峰[M+H]+=439.20，二級質(zhì)譜的主要裂解碎片離子（m/z）分別為339.15，311.05。與文獻比較，發(fā)現(xiàn)比卡波地那非質(zhì)荷比少14，同時含有相同的碎片離子m/z 339，m/z 311。推斷可能是卡波地那非失去甲基形成的，進一步通過核磁氫譜解析。

圖 3 樣品一級質(zhì)譜圖（A）和二級質(zhì)譜圖（B）

3.3 1H-NMR解析

經(jīng)制備液相純化，得到類白色的固體化合物18.4 mg，純度為98.9%。該化合物核磁氫譜解析結(jié)果：1H NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ11.01（s，1H），8.60（d，J = 2.3 Hz，1H），7.60（dd，J = 8.5，2.3 Hz，1H），7.11（d，J = 8.6 Hz，1H），4.36（q，J = 7.0 Hz，2H），4.29（s，3H），3.84（s，2H），3.70（s，2H），2.94（t，J = 7.6 Hz，2H），2.59（s，4H），2.43（s，3H），1.89（h，J = 7.4 Hz，2H），1.65（t，J = 7.0 Hz，3H），1.05（t，J = 7.3 Hz，3H）。與文獻中報道的去甲基卡波地那非核磁共振氫譜[24]對比，信號一致，確證該未知化合物為去甲基卡波地那非，化合物結(jié)構(gòu)見圖 4。

圖 4 去甲基卡波地那非結(jié)構(gòu)

3.4 樣品測試

為進一步確認，后經(jīng)與對照品比對，結(jié)果確證未知物為去甲基卡波地那非。

3.4.1 質(zhì)譜測定

經(jīng)與去甲基卡波地那非對照品比對，確證樣品與對照品一級和二級質(zhì)譜圖（見圖 5）相一致。根據(jù)二級質(zhì)譜碎片推斷去甲基卡波地那非的裂解機理（見圖 6）：母離子m/z 439.20失去哌嗪環(huán)形成碎片離子m/z 339.15，再失去乙基，得到碎片離子m/z 311.05。

圖 5 去甲基卡波地那非對照品一級質(zhì)譜圖（A）與二級質(zhì)譜圖（B）

圖 6 去甲基卡波地那非質(zhì)譜裂解規(guī)律

3.4.2 含量測定

采用高效液相色譜法測定，去甲基卡波地那非對照品保留時間為7.850 min，其最大吸收波長為209 nm和295 nm，與樣品一致。同時計算得出樣品中去甲基卡波地那非含量為5.015 mg·g-1。

4 討論

在抗疲勞類保健食品中發(fā)現(xiàn)的新化合物經(jīng)HPLC-DAD、LC-MS/MS和1H-NMR確證，該化合物為5-（5-（4-甲基哌嗪-1-羰基）-2-乙氧苯基）-1-甲基-3-丙基-1H-吡唑[4，3-d]嘧啶-7（6H）-酮，命名為去甲基卡波地那非。該化合物未在國內(nèi)報道，沒有相關(guān)檢驗標(biāo)準(zhǔn)，因此，有必要完善檢驗標(biāo)準(zhǔn)，為打擊不法行為提供技術(shù)支撐。

去甲基卡波地那非在市場上并沒有合法來源，可能不法分子通過自制的化工原料添加到保健食品或功能性食品中，由于添加劑量隨意，且未經(jīng)過系統(tǒng)的毒理學(xué)研究，消費者在不知情的情況下日常服用添加該類化合物的保健食品，會對人體健康帶來巨大危害，國外已有服用該化合物致死案例的報道。

王珂 1, 董培智 2, 申國華 2, 張祿 2, 梁卜文 2, 郭景文 2