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摘要

本文簡(jiǎn)述了67/548文件中粒度分布和纖維長(zhǎng)度檢測(cè)方法，并對(duì)其適用范圍和用途提供了指導(dǎo)。

 

前言

為全面公布67/548/EEC文件中的新藥，附錄Ⅶ A表明，當(dāng)某種即將上市的化學(xué)藥品在暴露過程中存在吸入風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，需要對(duì)其粒度進(jìn)行檢測(cè)。

通常，新藥申報(bào)資料中應(yīng)包含相應(yīng)的粒度分布檢測(cè)方法，因?yàn)樗幬锏奈攵拘耘c粒度分布密切相關(guān)。

另一方面，我們需要對(duì)對(duì)新藥和已上市的藥物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以判斷其形成氣體粉塵的可能性，以及氣體粉塵的類型（如：含纖維的，不含纖維的）。

迄今為止，67/548/EEC文件中的附錄V中未指明檢測(cè)藥品粒度分布的方法。

此外，OECDTG 110中粒度分布檢測(cè)方法只適用于不溶于水的化合物，而對(duì)溶于水的藥物并不適用。

本粒度檢測(cè)指南的初稿形成于Netherlands，并經(jīng)過EUNational Co-ordinators多次討論確定了檢測(cè)方法和主管當(dāng)局。

綜合各成員國(guó)專家意見，形成了此檢測(cè)指南的第三版修訂版文件，并在成員國(guó)有關(guān)67/548/ECC（Ispra，1996年3月24-25日）中科技議題的第二次會(huì)議中生成了最終的草案。會(huì)議通過在吸入毒性檢測(cè)方法問世之前，將該草案作為吸入毒性以及其他相應(yīng)研究的臨時(shí)參考文件。在51屆主管當(dāng)局會(huì)議中通過了科技大會(huì)中的決定，并授權(quán)執(zhí)行 67/548/EEC文件。

在此提供本指南文件，以方便有關(guān)各方進(jìn)行磋商和使用。

 

1.引言

通常，依據(jù)吸入毒性策略（67/548/EEC文件第七版修正案），以及確定急性毒性作用途徑和28天基線研究的必要性，決定了對(duì)于粒度檢測(cè)方法的需求。該研究策略為執(zhí)行吸入毒性研究提供了重要論點(diǎn)依據(jù)。藥品通常會(huì)含有特定的可吸入的顆粒大小范圍（如，可能沉積在呼吸道的任何地方）。吸入粒徑的大小范圍測(cè)定十分重要，因?yàn)檫@影響著藥品在呼吸道的沉積區(qū)域，以及其是否會(huì)形成吸入問題。此外，顆粒粒徑分布可以作為支持吸入測(cè)試的論據(jù)。

因此，用于準(zhǔn)確測(cè)定粒徑分布的方法十分必要。如,在EN481（1993）中，規(guī)定使用空氣動(dòng)力學(xué)直徑作為測(cè)量的基礎(chǔ)。

空氣動(dòng)力學(xué)直徑為顆粒的單位密度球體直徑，可用于比較不同顆粒的大小、形狀以及密度，從而預(yù)測(cè)該顆粒在呼吸道可能的沉積位置。而反應(yīng)實(shí)際直徑的測(cè)量直徑、光學(xué)直徑以及幾何直徑，與顆粒在呼吸道的沉積位置并無直接關(guān)聯(lián)。

EN481(1993)中對(duì)沉積顆粒作如下分類：

可吸入顆粒（該顆?？杀槐亲雍妥煳耄?，實(shí)驗(yàn)表明空只有空氣氣動(dòng)力學(xué)直徑＜100μm的顆粒才能被吸入。

可入胸顆粒（該顆?？蛇M(jìn)入喉嚨），粒徑中值為11.64μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)差是1.5μm。研究表明空氣中50%的空氣動(dòng)力學(xué)直徑為10μm的顆粒，屬于胸部沉積組分。

可呼吸顆粒（該顆?？傻竭_(dá)肺泡），粒徑中值為4.25μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)差為1.5μm。研究表明空氣中50%的空氣動(dòng)力學(xué)直徑在4μm的顆粒，屬于可呼吸顆粒。

問題是如何將塊狀藥物的粒度分布通過物理測(cè)量的方式轉(zhuǎn)化為空氣動(dòng)力學(xué)直徑，然后轉(zhuǎn)化為可吸入或可呼吸顆粒占有比?？梢韵葘⑺幬锾幚沓蓺怏w分散體，然后測(cè)量其粒度分布?，F(xiàn)有幾種商業(yè)儀器可以用來測(cè)量藥物的空氣動(dòng)力學(xué)直徑（見5）。我們應(yīng)該注意到僅有滾筒法（見5.3）可以用來區(qū)分可吸入、入胸和呼吸顆粒的百分比，而其他儀器僅能測(cè)定出可呼吸顆粒的比例。

可呼吸顆粒的存在可能會(huì)引發(fā)健康問題，因此粒度分布的結(jié)果決定著吸入毒性策略，優(yōu)先選擇能夠用來確定檢測(cè)可呼吸顆粒的方法。

第5節(jié)所描述的方法能用來測(cè)定呼吸性微粒以及可吸入顆粒的分布，其通過計(jì)算總氣體動(dòng)力學(xué)中位數(shù)直徑（MMAD）及幾何標(biāo)準(zhǔn)差（GSD）以表示顆粒大小。MMAD是一個(gè)粒子樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，當(dāng)MMAD值為5μm即表示整個(gè)樣品顆粒中50%的空氣動(dòng)力學(xué)直徑大于5μm，50%的空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于5μm。

其它方法（見4）需要間接地通過測(cè)定其粒度和密度來計(jì)算氣動(dòng)直徑。如果運(yùn)用得當(dāng)，這些方法可以用來表示顆粒的空氣動(dòng)力特性和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

我們可以選擇使用第5節(jié)中的方法來替代第4中方法，通過第5節(jié)中的方法確定可呼吸和可吸入顆粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算MMAD值，來確定是否存在可吸入風(fēng)險(xiǎn)。

我們應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娜映绦蛞员阒苽淠軠?zhǔn)確反應(yīng)結(jié)果的測(cè)試樣。此外，顆粒的粒度分布還受工藝方法，后續(xù)環(huán)境以及人工轉(zhuǎn)移的影響。

 

2.確定粒度分布的重要準(zhǔn)則

1）目前OECD110中所描述的方法用來確定樣品的粒度分布，而不是樣品的空氣粉塵。因此這些方法并不能提供在處理該化學(xué)品時(shí)所面臨樣品暴露的解決措施。此外，這些方法僅適用于水不溶的粉末性產(chǎn)品（＜10-6g/l）。

2）用于確定MMAD的方法，需要用合適的生成設(shè)備和正確的采樣技術(shù)來生成具有代表性的試驗(yàn)大氣。由此假設(shè)這些方法適用于氣載顆粒物（灰塵、煙塵、煙）、噴霧顆粒（濕氣溶膠）或者分散粒子（干氣溶膠。）

3）用作分析的小樣必須能夠代表多公斤的不同批次樣品。因此，我們要注意避免樣品粒徑分布發(fā)生改變。在樣品預(yù)處理過程中，我們應(yīng)盡量避免加入分散劑、攪拌或低頻超聲處理。

4）我們應(yīng)特別注意一個(gè)事實(shí)，就是非導(dǎo)電粒子在非導(dǎo)電液體中可能帶電，從而導(dǎo)致某些的不具有代表性的顆粒存在。因此在粒度分布測(cè)定過程中，我們一定要考慮到粒子的靜電荷。靜電粒子的行為不同可能會(huì)影響采樣過程。

5）樣品應(yīng)做簡(jiǎn)單的光學(xué)顯微鏡檢查，以確定粒子的大概的特性（纖維、感光底片、球體、針狀物等）。

6）為了更好的選擇檢測(cè)方法，我們建議預(yù)先確定在特定溫度下（空隙容積）每個(gè)樣品中粒子的相對(duì)密度，而這可以通過氣體離心機(jī)實(shí)現(xiàn)。通過這種方法，我們可以得到樣品處理后在平衡大氣中放置時(shí)間的影響。

 

3.選擇可呼吸/可吸入顆粒物粒度分布的檢測(cè)方法流程圖

本節(jié)所描述的方法均在第4節(jié)和第5節(jié)中提到，而這些方法均可用于測(cè)定可呼吸/可吸入顆粒物。本流程中不包括僅可檢測(cè)可吸入組分而不給出詳細(xì)分布的方法（見附錄）。

 

4.粒度分布的檢測(cè)方法

顯微鏡檢查、沉淀法和電阻法是常用方法，而激光多普勒風(fēng)速測(cè)量技術(shù)使用較少。這些方法能夠測(cè)定樣品的顆粒大小，而不涉及粉塵、分散和霧化的顆粒。因此，不能測(cè)定出MMAD值。但是，這些方法能反映出是否存在可呼吸顆粒物。

這些方法目前大多數(shù)收載于OECD110指導(dǎo)原則。目前使用的這些技術(shù)不適合測(cè)定呼吸性顆粒大?。ㄒ姼戒洠?。

 

4.1顯微鏡法（見OECD 110）

適用范圍：各種粒子

粒徑范圍：0.5-5000μm（光學(xué)顯微鏡）；0.01-10μm（SEM/TEM）

樣品最好直接制備，以免影響顆粒的形狀和大小。對(duì)于小顆粒（＜0.1μm）建議使用掃描或透射電鏡。

結(jié)論：該方法適用于測(cè)定呼吸顆粒物和可吸入顆粒物的粒徑分布但不能測(cè)定MMAD值.

 

4.2篩分法（見OECD 110）

適用范圍：干燥的粉末/顆粒

粒徑范圍：100-10000μm（鐵絲網(wǎng)篩/金屬篩）；5-100μm（微孔篩）

鋼絲網(wǎng)篩和多孔板金屬篩的篩分范圍為100-10000μm，不適用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒的分布。

微孔篩（5-100μm范圍內(nèi)）可能會(huì)得到更好的結(jié)果。但是，由于這些篩網(wǎng)通常與機(jī)械振動(dòng)或超聲波振動(dòng)聯(lián)合使用，故可能會(huì)導(dǎo)致樣品的中位尺寸和形狀發(fā)生改變。

結(jié)論：篩分法不適用于測(cè)定可呼吸顆粒物的粒徑分布，但可用于測(cè)定可吸入顆粒物的粒徑分布。同樣該法不能測(cè)定MMAD值。

 

4.3沉淀法（重力沉降）（見OECD 110;DIN 66115）

適用范圍：干燥的粉末/顆粒

粒徑范圍：2-200μm

該方法完全基于顆粒在液體中的重力沉降，并且可以測(cè)定有效的流體動(dòng)力半徑。顆粒在液體中的沉降取決于液體與顆粒物質(zhì)的比重之差，其中顆粒物質(zhì)的比重大于液體比重。

OCED 110推薦使用二元或三元混合乳膠球（2-100μm）作為校準(zhǔn)物質(zhì)。但是，目前人們對(duì)乳膠球的使用還存有爭(zhēng)議，主要在于（a）表面不光滑，（b）直徑受濕度的影響較大，（c）在貯存過程中會(huì)發(fā)生凝結(jié)和再聚合。

像OECD110中所提那樣，要想獲得有效地流體動(dòng)力半徑分布值，我們應(yīng)該重復(fù)測(cè)定三次，并且兩兩結(jié)果之間不得差高于20%。此方法粒徑范圍為＞200μm，2-200μm及＜2μm，并且給出在2-200μm區(qū)間的分布曲線。因此不能準(zhǔn)確估計(jì)出＜10μm（可呼吸顆粒）和＜100μm（可吸入顆粒）顆粒的數(shù)量。最佳的粒徑范圍為：＞100μm，10-100μm及＜10μm，并且對(duì)＜10μm的區(qū)間作分布曲線。

此外，該方法要求使用大量的半徑間隔物質(zhì)來模擬半徑分布曲線。

大量的聚合物粉末在液體中是無法被測(cè)量的，因?yàn)樗鼈兊南鄬?duì)密度會(huì)與使用的液體的相對(duì)密度太接近而導(dǎo)致沉降時(shí)間過久。

該法也可以測(cè)定水溶物的粒徑分布，使用一種不能溶解樣品且不被樣品吸附的溶劑，溶劑密度與樣品密度不同，以獲得合適的沉降時(shí)間。

結(jié)論：該法可以用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒的大小。多數(shù)情況下無法測(cè)定MMAD值，僅在某些特定情況下能測(cè)定MMAD值。

 

4.4電阻法（如庫爾特法）（見OECD 110）

適用范圍：干燥的粉末/顆粒

粒徑范圍：1-1000μm

庫爾特計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定懸浮在電解液中的樣品，當(dāng)顆粒隨電解液通過小孔管時(shí)，電導(dǎo)率發(fā)生變化，從而測(cè)定出顆粒大小。這其中一個(gè)重要的參數(shù)是顆粒在電解液中的沉降速度，而該沉降速度這取決于顆粒的密度和直徑。所以密度不同的顆?？梢酝ㄟ^此法測(cè)定。

但是，庫爾特計(jì)數(shù)電阻法僅適用于流體中完全電絕緣體的粒子。此外，顆粒和流體密度差距不能太大。當(dāng)密度差太大時(shí)，我們需要增加流體密度，并在分析前和分析過程中加以攪拌。

結(jié)論：該法可以用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒的大小。無法測(cè)定MMAD值。

 

4.5相位多普勒測(cè)速

適用范圍：干燥的粉末/顆粒

粒徑范圍：0.5-80μm（空氣中）；0.5μm-mm（液體中）

使用這種昂貴的技術(shù)，我們可以測(cè)量空氣或液體中粒度分布。該方法假定粒子是具有已知折射率的球形。

結(jié)論：該法可以用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒的粒度。無法測(cè)定MMAD值。

 

4.6纖維長(zhǎng)度和粒徑分布的測(cè)定（見OECD 110）

適用范圍：纖維物質(zhì)

粒徑范圍：0.1-100μm（直徑），5-300μm（纖維長(zhǎng)度）

纖維是水不溶性顆粒，其長(zhǎng)度/直徑≥3，其中直徑≤100μm。

光鏡檢查法應(yīng)用于含纖維的或者能釋放纖維的物質(zhì)，即需要確保樣品中纖維的存在，同時(shí)應(yīng)考慮影響纖維形狀的雜質(zhì)。

樣品制備過程中必須格外小心，以避免纖維斷裂和結(jié)塊。樣品需在罩內(nèi)或潔凈室內(nèi)處理，避免空氣纖維的污染。

樣品可以通過以下兩種方式制備，（a）在水中緩慢搖晃或渦流混合制備懸浮液。不推薦磁力攪拌，因?yàn)檫@會(huì)破壞纖維結(jié)構(gòu)。（b）直接將干燥的樣品轉(zhuǎn)移到銅帶上或者使用噴霧器或吸液管將干燥纖維噴到銅帶上。推薦使用直接轉(zhuǎn)移法直接測(cè)量干燥的纖維樣品。第一種方法需要將樣品進(jìn)行再次干燥，顆粒的大小和形狀會(huì)收到影響。噴涂可能導(dǎo)致尺寸差異。

測(cè)定樣品中的小粒徑纖維（≥0.1μm）則需要使用掃描電子顯微鏡法（SEM）或者轉(zhuǎn)移電子顯微鏡法（TEM）。

OECD 110指出，顆粒長(zhǎng)度和直徑分布應(yīng)至少單獨(dú)測(cè)量?jī)纱?，至少?yīng)計(jì)算70根纖維。在給定的直方圖中，任何兩個(gè)值的差值均不應(yīng)超過50%或3根較大的纖維。如果存在細(xì)長(zhǎng)的纖維，則需進(jìn)一步采用更為精確的方法進(jìn)行測(cè)量。

光鏡檢查法測(cè)量長(zhǎng)度/直徑的比值僅適用于直纖維，測(cè)量中應(yīng)避免弧形和蜷縮的纖維。

結(jié)論：該法適用于測(cè)量可呼吸和可吸入顆粒中的纖維長(zhǎng)度

 

5.氣動(dòng)、分散或霧化粒子的測(cè)量

本節(jié)中使用的方法需要使用合適的生成設(shè)備和正確的采樣技術(shù)來生成具有代表性的測(cè)試大氣。這些方法可以測(cè)定空氣中的顆粒，從而測(cè)定顆粒的MMAD值，因此這些方法可作為測(cè)定MMAD值的首選方法。噴氣篩法不適用于測(cè)定可呼吸顆粒的粒徑（見附錄）。

 

5.1慣性撞擊法

適用范圍：適用于所有顆粒

粒徑范圍：0.1-20及0.5-80μm

慣性撞擊法可以測(cè)量氣溶膠/塵霧的粒度分布。空氣樣品由一個(gè)多級(jí)裝置收集提取。顆粒由于不同的大小和慣性，會(huì)被不同級(jí)數(shù)的收集盤收集。在取樣前后對(duì)每一級(jí)進(jìn)行稱重，從而根據(jù)每級(jí)的噴射速度計(jì)算截止粒徑，并計(jì)算得出MMAD。盡管該法存在某些局限，如粒子反彈、超載和流量波動(dòng)等，但該法依然是測(cè)量氣溶膠粒度分布的較佳方法。

結(jié)論：該法可以用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒的粒度分布和MMAD值。

 

5.2激光散射法

適用范圍：適用于所有顆粒

粒徑范圍：0.1-100μm

一般來說，入射光經(jīng)過散射會(huì)產(chǎn)生明顯的差異，這種差異可以通過檢測(cè)器讀取。顆粒粒徑和性質(zhì)的差異也因此會(huì)產(chǎn)生不同的散射和衍射結(jié)果。因此，樣品檢測(cè)前需要用與被測(cè)樣品相似的顆粒（粒徑范圍一致）來校準(zhǔn)儀器。激光散射法適用于球體、立方體和單晶體等幾何顆粒。

顆粒大小將通過光學(xué)確定，并通過校正計(jì)算MMAD值。

結(jié)論：該法可以用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒的粒度分布和MMAD值。

 

5.3 滾筒法

適用范圍：干燥的粉末/顆粒/纖維

粒徑范圍：0.5-10000μm

這種方法目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，在旋轉(zhuǎn)滾筒中反復(fù)升降顆粒以產(chǎn)生粉塵云，從而進(jìn)行大小選擇性取樣。從滾筒中抽出的空氣通過一個(gè)特別設(shè)計(jì)的出口和一個(gè)由兩個(gè)多孔聚氨酯泡沫和一個(gè)膜過濾器組成的三級(jí)分餾系統(tǒng)。通過重力的方式測(cè)定每個(gè)收集階段收集的粉塵質(zhì)量，從而測(cè)定ISO/CEN會(huì)議中定義的生物學(xué)上可吸入、可入胸和可呼吸組分的粒度分布。

該方法模擬了大量工業(yè)過程中顆粒的處理過程，確定了顆粒在空氣狀態(tài)下的生物相關(guān)粒度分?jǐn)?shù)。通過對(duì)粉塵收集階段的成分分析，我們可以確定顆粒全粒徑分布。

結(jié)論：該法可以用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒的粒度分布和MMAD值。

 

6.文獻(xiàn)

Fissan,H. and Schwientek,G.(1987).Sampling and transport of aerosols. TSI Journal Particle Intrumentation,2,10p.

Marple, V.A.etal.(1976).Aerodynamic particle size calibration of optical counters. J.AerosolSc. 7,425-433.

Miller, F.J.er al.(1979). Sizeconsiderations for establishing a standard for inhalable particles. J.AirPoll.Contr.Ass.29,610-615.

 

7.附件

本節(jié)中所述的這些方法僅適用于測(cè)定可吸入顆粒大小，或僅指示可呼吸和可吸入顆粒的存在。

 

7.1 淘析法（見OECD 110）

適用范圍：干燥的粉末/顆粒

粒徑范圍：15-115μm

通過淘析技術(shù)，顆粒以不同的速度通過柱子。根據(jù)速度計(jì)算粒徑，根據(jù)各速度下淘析出來的樣品重量計(jì)算粒度分布。

由于粒子需要一定的質(zhì)量來克服速度力和布朗力，淘析作用僅限于大于15μm的顆粒。

結(jié)論：該方法不適用于測(cè)定可呼吸顆粒物的粒度分布，但可用于測(cè)定可吸入顆粒物的粒度分布。此外該法不能測(cè)量MMAD值。

 

7.2空氣噴射篩分法

適用范圍：所有種類顆粒

粒徑范圍：10-10000μm

利用空氣噴射作為動(dòng)力推動(dòng)顆粒通過篩網(wǎng)，實(shí)現(xiàn)精密篩分。該方法還能測(cè)定樣品中的非漂浮部分。

顆粒的聚集將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。此外，由于檢測(cè)下限僅為10μm，故該方法不適用于測(cè)量可呼吸顆粒的粒度分布。

結(jié)論：該方法不適用于測(cè)定可呼吸顆粒物的粒度分布，但可用于測(cè)定可吸入顆粒物的粒度分布。此外該法不能測(cè)量MMAD值。

 

7.3 旋風(fēng)分離法

適用范圍：所有種類顆粒

粒徑范圍：0.1-200μm

旋風(fēng)分離法是測(cè)定試驗(yàn)大氣樣品中是否存在可呼吸和可吸入顆粒物的一種簡(jiǎn)單方法。使用旋風(fēng)分離器，需要獲得4.25和100μm的截止點(diǎn)。通過旋風(fēng)分離器測(cè)量顆粒重量，可以確定是否必須采用5.1和5.2中描述的更復(fù)雜的方法來確定小于10μm的顆粒的粒度分布。

結(jié)論：該方法適用于測(cè)定可呼吸和可吸入顆粒物的比例。但無法測(cè)定顆粒分別，因此無法確定MMAD值。