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引  言

 

• 在新藥研發(fā)的Non-Clinical階段，為什么要開(kāi)發(fā)具有穩(wěn)定性指示作用的方法？

• Non-Clinical階段的降解試驗(yàn)與后階段有何不同？需要考慮哪些注意事項(xiàng)？

• 方法驗(yàn)證中的疑難問(wèn)題是否已困擾你很久？找到答案了嗎？

   

本文由默克、禮來(lái)等著名公司專家及高校專家撰寫，將引領(lǐng)你和團(tuán)隊(duì)從多維度思考問(wèn)題并獲得答案。 

 

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藥物非臨床研究與穩(wěn)定性指示方法

 

 

非臨床研究制劑（也稱為臨床前或非GLP制劑）在藥物的早期開(kāi)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。這種制劑能夠把藥物（原料藥）帶入到試驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)和毒理學(xué)研究。由于這些研究最終會(huì)用于支持人的劑量和安全性，因此對(duì)了解藥物的濃度、PK/PD、工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)的安全性數(shù)據(jù)是很重要的。因此，業(yè)內(nèi)人士已開(kāi)展對(duì)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)和定量藥物活性成分、雜質(zhì)、降解雜質(zhì)的方法進(jìn)行開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證。這種方法往往能夠提供穩(wěn)定性的趨勢(shì)性結(jié)果，因此稱為穩(wěn)定性指示方法。本文對(duì)非臨床研究制劑穩(wěn)定性指示方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證進(jìn)行了綜述，為從事相關(guān)研究的團(tuán)隊(duì)提供指導(dǎo)。

 

藥物開(kāi)發(fā)根據(jù)需要包括許多階段。盡管非臨床階段并不需要分析降解產(chǎn)物，但是很多公司還是要更多了解活性成分，如，在這個(gè)階段研究降解產(chǎn)物。此階段獲得的毒理學(xué)數(shù)據(jù)能了解藥物、雜質(zhì)及降解產(chǎn)物的安全性，因此后續(xù)階段中會(huì)出現(xiàn)哪些雜質(zhì)、每個(gè)雜質(zhì)有多少量是很重要的。目前的指導(dǎo)原則強(qiáng)調(diào)后期的驗(yàn)證，沒(méi)有在非臨床階段涉及穩(wěn)定性指示方法。本文綜述了幾種方法來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定性指示方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定。這些建議不是技術(shù)上必須遵循的規(guī)定，而是為那些想把這種方法引入到非臨床研究中的人員提供基本思路。本文重點(diǎn)關(guān)注小分子藥物非臨床制劑雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的分析方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證。 

 

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穩(wěn)定性指示方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證中的重要問(wèn)題分析

 

 

研究中使用的所有分析方法都應(yīng)該是符合其使用目的，能夠獲得可靠結(jié)果并沒(méi)有顯著偏差的。這些非臨床研究中的分析方法主要在于提供微量雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的定量結(jié)果。用于穩(wěn)定性指示方法的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證應(yīng)基于此目的進(jìn)行設(shè)計(jì)，保證具有足夠的選擇性、靈敏度。有幾個(gè)重要的部分需要考慮：

 

（1）降解試驗(yàn)

 

在非臨床研究中，如果有足夠的時(shí)間和樣品，在穩(wěn)定性指示方法的開(kāi)發(fā)中應(yīng)考慮進(jìn)行降解試驗(yàn)研究。通常，在這個(gè)階段，藥物的工藝雜質(zhì)已經(jīng)確定，強(qiáng)制降解研究可以為藥物由于化學(xué)或者物理不穩(wěn)定性結(jié)果提供一個(gè)多維度的分析。方法開(kāi)發(fā)中的降解試驗(yàn)應(yīng)對(duì)潛在的氧化、光照、水解雜質(zhì)具有選擇性。需要注意的是降解試驗(yàn)中產(chǎn)生的降解物在正常貯藏條件也可能或不可能產(chǎn)生。如果降解產(chǎn)物可能引起安全性或毒性問(wèn)題，在臨床前研究中應(yīng)進(jìn)行必要研究。

  

所有的降解試驗(yàn)可以使用活性成分預(yù)期濃度的儲(chǔ)備液進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在活性成分的預(yù)期劑量濃度下用原液進(jìn)行，可以采用確定處方進(jìn)行配制，如果處方?jīng)]有最終確定，可采用溶液進(jìn)行。

 

考慮降解條件，儲(chǔ)備液可以采用乙腈-水和甲醇-水作為溶劑配制，推薦配制質(zhì)控樣品。所有的降解產(chǎn)物的UV光譜應(yīng)采用PDA檢測(cè)器測(cè)定。如果沒(méi)有PDA檢測(cè)器，UV/Vis檢測(cè)器應(yīng)使用210-220nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，但是此時(shí)，是無(wú)法獲得峰純度數(shù)據(jù)的。UV光譜應(yīng)與活性成分進(jìn)行比較，以確定雜質(zhì)、降解產(chǎn)物的相對(duì)響應(yīng)是否與主峰一致。例如如果方法的檢測(cè)波長(zhǎng)為235nm，降解產(chǎn)物在這個(gè)波長(zhǎng)下沒(méi)有吸收，那么這個(gè)雜質(zhì)就不會(huì)獲得質(zhì)量平衡。任何降解試驗(yàn)應(yīng)在短期或者不苛刻的條件下進(jìn)行。

 

主要降解途徑的敏感性可以通過(guò)觀察活性成分的降解程度來(lái)獲得。如果出現(xiàn)10%或更少，說(shuō)明在臨床前制劑中出現(xiàn)的可能性小，如果藥物損失較大，說(shuō)明在臨床前制劑中出現(xiàn)潛在降解產(chǎn)物的可能性大，應(yīng)該在方法驗(yàn)證中對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分離度和定量考察。確定關(guān)鍵的降解途徑有助于對(duì)臨床前處方和貯藏條件進(jìn)行確定。以下為幾個(gè)常見(jiàn)的降解試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

 

• 自由基氧化可以使用偶氮二異丁腈（Azobisisobutyronitrile，AIBN）來(lái)進(jìn)行研究。取約10mg的AIBN，加入到盛有10ml儲(chǔ)備液的20ml量瓶中，在40℃下反應(yīng)1-3天。

 

• 親核氧化反應(yīng)可以通過(guò)在儲(chǔ)備液中或處方中加入稀過(guò)氧化氫溶液，在室溫下反應(yīng)24h進(jìn)行?？赡墚a(chǎn)生N-氧化物或亞砜雜質(zhì)。

 

• 酸水解可以通過(guò)在儲(chǔ)備液中或處方中加入稀鹽酸溶液進(jìn)行。降解溶液可以在室溫或60℃條件下放置3天。同理，堿水解可以通過(guò)稀氫氧化鈉溶液以相同方式獲得。二者可采用相應(yīng)的酸堿稀溶液進(jìn)行中和。

   

• 光降解試驗(yàn)可以采用乙腈/水或甲醇/水儲(chǔ)備液或計(jì)劃處方，在ICH規(guī)定光照箱中進(jìn)行10w/m2的20h試驗(yàn)。

   

• 熱降解試驗(yàn)可以采用儲(chǔ)備液在高溫下進(jìn)行，典型條件是在60°C 進(jìn)行24–48 h, 基于貯藏條件，其他室溫以上的條件也可以采用。

   

• 質(zhì)量平衡應(yīng)進(jìn)行考慮，有很多因素會(huì)導(dǎo)致質(zhì)量不平衡，如：降解產(chǎn)物沒(méi)有發(fā)射團(tuán)、在死體積時(shí)洗脫下來(lái)、極性太大、或由于疏水性強(qiáng)，特別是如果形成了二聚體或加合物，而沒(méi)有在梯度條件下被洗脫下來(lái)。

 

對(duì)于非臨床分析，通常認(rèn)為所有的雜質(zhì)具有相同的響應(yīng)因子，如果在檢測(cè)波長(zhǎng)下降解產(chǎn)物的響應(yīng)因子與火活性成分差異較大（超過(guò)20%），可能就不會(huì)獲得質(zhì)量平衡。如果由于上述原因沒(méi)有獲得質(zhì)量平衡，結(jié)果應(yīng)進(jìn)行記錄，并在后續(xù)開(kāi)發(fā)階段進(jìn)行進(jìn)一步研究。

 

（2）降解試驗(yàn)的問(wèn)題解答

 

與任何方法開(kāi)發(fā)項(xiàng)目一樣，實(shí)際發(fā)生的事情往往與計(jì)劃不同。以下是一些處理問(wèn)題的方法。

 

助溶劑：當(dāng)采用乙腈作為助溶劑時(shí)，有可能形成甲酸。甲酸與仲胺在溶液中會(huì)形成加合物。在這種情況下，當(dāng)進(jìn)行水解研究時(shí)，可以考慮使用其他溶劑，如DMSO。

  

pH值：當(dāng)使用極端pH值進(jìn)行降解研究時(shí)，如果采用HPLC/UV檢測(cè)或發(fā)現(xiàn)峰形較差時(shí)，要使注入HPLC的溶液的pH值與流動(dòng)相的pH值接近。建議流動(dòng)相或緩沖溶應(yīng)具有更強(qiáng)的離子強(qiáng)度來(lái)控制溶液的pH值，以使峰形不受影響。強(qiáng)烈建議在HPLC之前檢查樣品溶液的pH值，一般pH值范圍為2-8對(duì)大部分色譜柱是可以接受的，但是應(yīng)關(guān)注廠家的推薦范圍。

 

混懸液：對(duì)于懸浮液制劑樣品，在進(jìn)行任何分析前必須保證均勻性。通常包括將樣品進(jìn)行渦旋或強(qiáng)力混合，確保代表性。如果溶液不均一，將會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)和降解產(chǎn)物含量測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

 

雜質(zhì)水平：注入HPLC的API濃度應(yīng)足夠高，確保所有相關(guān)雜質(zhì)/降解產(chǎn)物峰能夠出峰并定量。雜質(zhì)/降解產(chǎn)物峰沒(méi)有彼此分開(kāi)的，可以通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相組成、pH、柱溫、柱長(zhǎng)、梯度斜率進(jìn)行調(diào)節(jié)。

 

色譜方法：梯度洗脫優(yōu)于等度，應(yīng)以高比例水相開(kāi)始，以高有機(jī)相比例結(jié)束。注意不要使緩沖液在高比例有機(jī)相中出現(xiàn)渾濁。采用UV檢測(cè)時(shí)，推薦使用盡可能低的波長(zhǎng)確保雜質(zhì)/降解產(chǎn)物峰能夠被檢測(cè)到。采用API的最大吸收波長(zhǎng)可能不會(huì)檢測(cè)到在這個(gè)波長(zhǎng)下沒(méi)有的降解產(chǎn)物峰。采用PDA檢測(cè)器可以檢測(cè)峰純度和光譜圖來(lái)增加專屬性。推薦使用15cm或以上柱長(zhǎng)、≥5µm粒徑的色譜柱來(lái)增加HPLC分離度。對(duì)于UPLC，應(yīng)使用短的、細(xì)粒徑的色譜柱。色譜柱填料應(yīng)確保對(duì)pH和高比例水溶液耐用。C18為常用的色譜柱填料，色譜分離的目標(biāo)是通過(guò)使用恰當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗍闺s質(zhì)/降解產(chǎn)物峰分離，色譜柱的選擇對(duì)于成功進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證至關(guān)重要。

 

需要注意的事情如下：

 

• 與玻璃或塑料非特異性吸附

• 峰寬/峰形差是由于注入溶液的強(qiáng)度大于流動(dòng)相

• 不可接受的前沿/拖尾峰是由于pH不兼容

• 降解試驗(yàn)中降解產(chǎn)物間的分離度差

• 降解產(chǎn)物或活性物質(zhì)沒(méi)有充分保留

• 所有樣品在分析前應(yīng)進(jìn)行充分混合保證均一性

 

3

方法驗(yàn)證推薦方法

 

 

方法驗(yàn)證的目的是通過(guò)定性和定量數(shù)據(jù)證明非臨床制劑測(cè)試結(jié)果可靠和準(zhǔn)確。穩(wěn)定性指示方法的靈敏度和專屬性對(duì)于測(cè)定微量雜質(zhì)和降解產(chǎn)物來(lái)說(shuō)非常重要。驗(yàn)證參數(shù)和可接受范圍應(yīng)基于使用目的來(lái)確定，需要一定的準(zhǔn)確度和精密度。每一個(gè)參數(shù)和可接受范圍在方法驗(yàn)證方案中進(jìn)行設(shè)置。方法要能夠區(qū)分活性成分、已知降解產(chǎn)物及處方中的其他組分或與API相關(guān)的成分（如殘留起始原料、中間體、副產(chǎn)物、輔料等）并能夠保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

 

方法被驗(yàn)證后，對(duì)方法的任何更改都將需要進(jìn)行部分驗(yàn)證。部分驗(yàn)證通常包括對(duì)方法中任何參數(shù)的評(píng)估。此外，如果驗(yàn)證的方法被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，則要起草方法轉(zhuǎn)移方案。 

 

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方法驗(yàn)證參數(shù)

 

 

（1）專屬性/選擇性

 

專屬性/選擇性是指方法區(qū)分API和其他成分的能力。其他成分包括輔料、容器的溶出物、殘留溶劑、測(cè)試物相關(guān)的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物。專屬性/選擇性應(yīng)通過(guò)那些潛在干擾成分與活性成分的干擾情況（如輔料、空白溶劑）以及降解試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。色譜法中，其他峰應(yīng)與主峰分離，保證所積分的色譜峰的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。此外，對(duì)于降解樣品，應(yīng)采用PDA或MS對(duì)活性成分進(jìn)行峰純度評(píng)價(jià)，并與新配制的溶液進(jìn)行比較，確保沒(méi)有與主峰共洗脫出色譜峰。已知雜質(zhì)或降解產(chǎn)物應(yīng)加入到新配制的含活性成分的溶液中，確保與被測(cè)定峰完全分離。

 

（2）準(zhǔn)確度

 

準(zhǔn)確度表示測(cè)量結(jié)果與理論結(jié)果的接近程度。如可能，可把降解雜質(zhì)以活性成分的不同水平加入到樣品中。如果不能獲得，降解樣品可以用來(lái)測(cè)定方法的準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度采用待測(cè)物的回收率百分比、相對(duì)誤差或者與理論值的偏差來(lái)表示。方法的準(zhǔn)確度與方法的使用目的有關(guān)。

 

（3）精密度

 

精密度表示在相同儀器條件下待測(cè)成分每個(gè)測(cè)定結(jié)果的接近程度。低含量雜質(zhì)的精密度應(yīng)采用絕對(duì)差而不是%RSD或%CV表示，因?yàn)槎邥?huì)受到低含量雜質(zhì)的負(fù)面影響。精密度應(yīng)采用至少三份（推薦5-6份）樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。

 

（4）線性與范圍

 

方法的線性范圍應(yīng)包括在整個(gè)分析濃度范圍。穩(wěn)定性指示方法的檢測(cè)能力很關(guān)鍵。分析物濃度與檢測(cè)器響應(yīng)值進(jìn)行線性回歸，當(dāng)相關(guān)系數(shù)≥0.99時(shí)線性關(guān)系良好。因?yàn)樵谠缙陂_(kāi)發(fā)階段單獨(dú)分離的雜質(zhì)單體可能沒(méi)有獲得，因此，每個(gè)雜質(zhì)對(duì)主峰的相對(duì)響應(yīng)因子（RRF）在非臨床階段被認(rèn)為是1。在開(kāi)發(fā)后期，這些值應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。

 

（5）檢測(cè)限與定量限

 

檢測(cè)限（LOD）是分析物與空白樣品背景響應(yīng)比的最低分析濃度，通常為空白樣品響應(yīng)值的3-5倍。定量限（LOQ）是具有一定準(zhǔn)確度與精密度的最低檢測(cè)濃度。二者可通過(guò)不同方法進(jìn)行測(cè)定。無(wú)論使用哪種方法，在記錄中應(yīng)進(jìn)行清晰準(zhǔn)確的記錄所采用的方法。通常，所采用的方法基于分析物的可獲得性。LOD有時(shí)不用測(cè)定，除非這個(gè)雜質(zhì)或降解產(chǎn)物是感興趣的成分或者其濃度低于LOQ，這種情況下獲得LOD數(shù)據(jù)可以有助于評(píng)估分析物的濃度。

 

（6）耐用性

 

耐用性通過(guò)方法參數(shù)的微小改變進(jìn)行評(píng)估。包括流速、流動(dòng)相組成、pH、柱溫、不同使用時(shí)間色譜柱、不同批號(hào)色譜柱、不同人員等。這些變化可以通過(guò)以下參數(shù)進(jìn)行評(píng)估：拖尾因子、分離度、理論板數(shù)、準(zhǔn)確度、精密度、LOD或LOQ。

 

（7）穩(wěn)定性

 

樣品在儲(chǔ)存、制備和分析中的穩(wěn)定性應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。包括API的穩(wěn)定性、制劑的穩(wěn)定性、過(guò)程處方的穩(wěn)定性、凍-融的穩(wěn)定性、活性儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性。每個(gè)溶液應(yīng)該采用恰當(dāng)?shù)膬?chǔ)藏條件（如室溫、冰箱、冷凍等）考察一定時(shí)間來(lái)評(píng)估穩(wěn)定性。降解產(chǎn)物的雜質(zhì)定量分析方法考察每個(gè)雜質(zhì)量。因此，這些方法提供了強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力。下面介紹了這些方法所涉及的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

 

• 原料穩(wěn)定性

   

通常，原料藥對(duì)照品應(yīng)在低于原料藥規(guī)定的長(zhǎng)期條件下貯藏。例如，如果原料藥規(guī)定在冰箱內(nèi)貯藏，那么對(duì)照品會(huì)在冷凍下貯藏。原料藥的穩(wěn)定性通過(guò)與對(duì)照品的比較進(jìn)行分析，并對(duì)增加的降解產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。通常需要在擬定的時(shí)間間隔點(diǎn)測(cè)定。

 

• 制劑穩(wěn)定性

 

制劑穩(wěn)定性是為了保證在使用期間的穩(wěn)定性。通過(guò)與新制備的對(duì)照溶液進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定。了解制劑的雜質(zhì)譜和降解程度有助于對(duì)每個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)鑒定。

 

• 使用過(guò)程穩(wěn)定性

 

樣品可能由于儀器故障或斷電重新進(jìn)樣，這時(shí)應(yīng)考察使用過(guò)程中的穩(wěn)定性，例如在存放條件（如在自動(dòng)進(jìn)樣器中）下進(jìn)行考察。通常需要在樣品的存放條件下進(jìn)行2-3天考察。

 

• 凍-融試驗(yàn)

 

根據(jù)預(yù)期貯藏條件和樣品分析方法，有必要評(píng)價(jià)凍-融穩(wěn)定性。如果進(jìn)行評(píng)價(jià)，應(yīng)包括樣品凍融的次數(shù)和條件。應(yīng)將凍和融樣品與新配制的相同濃度的活性成分對(duì)照溶液進(jìn)行比較。

 

• 貯備液

 

活性成分貯備液的穩(wěn)定性應(yīng)在預(yù)期貯藏條件和貯藏時(shí)間內(nèi)（如6h）進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估時(shí)應(yīng)將貯備液的響應(yīng)值與新配制的溶液進(jìn)行比較。 

 

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總結(jié)

 

 

了解新藥及其雜質(zhì)的毒性在臨床前研究中是重要的一部分內(nèi)容。非臨床研究中雜質(zhì)的分析方法應(yīng)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)拈_(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，包括準(zhǔn)確度、精密度、線性、范圍、選擇性、靈敏度、耐用性，要符合FDA相關(guān)指導(dǎo)原則規(guī)定。這些方法有助于在非臨床研究前以及非臨床研究中對(duì)制劑進(jìn)行穩(wěn)定性和純度的評(píng)價(jià)。按照本文推薦方法將確保所用的分析方法耐用、可靠。