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前言

 

《中國藥典》2020年版（ChP2020）編制大綱化學藥部分提出“加強國家藥品標準的科研工作，結(jié)合我國制藥工業(yè)生產(chǎn)實際，制定具有我國特色并具有科學性和適用性的標準”。在“涉及增強質(zhì)量可控性的方法學研究”方面，要求“加強方法中系統(tǒng)適用性試驗研究并在標準中予以體現(xiàn)，提高方法的重現(xiàn)性和準確性”。

 

 

 

 

ChP2020編制大綱既然明確提出了“系統(tǒng)適用性試驗研究”工作，說明這個試驗有著很重要的作用，特別是在提高方法的重現(xiàn)性和準確性方面。目前，在中國藥典有些品種的質(zhì)量標準中，特別是有關物質(zhì)項下，有的系統(tǒng)適用性試驗缺乏針對性，僅規(guī)定了主峰的理論板數(shù)或者與相鄰雜質(zhì)的分離度，在使用這個方法進行樣品檢測的時候重現(xiàn)性和準確性不夠好。此外，在ChP2015通則9101《藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則》中也沒有明確規(guī)定需要進行系統(tǒng)適用性試驗研究和驗證，僅在耐用性項下規(guī)定：測定條件小的變動應能滿足系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法的可靠性。因此在方法開發(fā)與驗證的過程中，存在著對系統(tǒng)適用性試驗認識和研究不足、缺少重視的情況。

本文結(jié)合案例，對“系統(tǒng)適用性試驗研究”進行一些思考，以供廣大研發(fā)人員在研究時借鑒。

 

一、主要國內(nèi)外藥典對系統(tǒng)適用性的一般要求

 

1、中國藥典四部通則中的規(guī)定

以常見的液相色譜法為例，在ChP2020第一次征求意見稿0512高效液相色譜法中規(guī)定：色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括色譜柱的理論板數(shù)（n）、分離度（R）、靈敏度、拖尾因子（T）、重復性共5個參數(shù)。要求按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)下進行試驗，如果不滿足要求，可對色譜系統(tǒng)進行適當調(diào)整，以符合要求。

（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）。理論板數(shù)可以評價色譜柱的性能，測定時應指明測定物質(zhì)，一般為待測物質(zhì)或內(nèi)標物的理論板數(shù)。

（2）分離度（R）。分離度用于評價待測物與被分離物之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關鍵指標。除另有規(guī)定外，待測物色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5。

（3）靈敏度。用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量雜質(zhì)的能力，通常以信噪比（S/N）表示。系統(tǒng)適用性可以設置靈敏度溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測能力。定量測定時要求信噪比應不小于10。

（4）拖尾因子（T）。用于評價色譜系統(tǒng)的對稱性。以峰面積作定量參數(shù)時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，但嚴重會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準確性，此時應在品種正文項下對其做出規(guī)定。

（5）重復性。用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進樣時響應值的重復性能。采用外標法時，通常取對照品溶液連續(xù)進樣5次，RSD應不大于2.0%。采用內(nèi)標法時，通常配制相當于80%、100%、120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其RSD應不大于2.0%。當待測成分是微量或痕量時，進樣量少或色譜峰響應值較小時，對RSD的要求可以適當放寬。

在ChP2015通則0502薄層色譜法中系統(tǒng)適用性項下規(guī)定了比移值（Rf）、檢出限、分離度、相對標準偏差。其中比移值系指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值。除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢査時，各雜質(zhì)斑點的比移值R以在0 .2?0 .8之間為宜。

在ChP2015通則0513離子色譜法、0521氣相色譜法、0531超臨界流體色譜法、0532臨界點色譜法、0542毛細管電泳法中關于系統(tǒng)適用性的規(guī)定為：除另有規(guī)定外，應照高效液相色譜法通則0512項下的規(guī)定。

在ChP2015通則0514分子排阻色譜法系統(tǒng)適用性項下規(guī)定，系統(tǒng)適用性試驗中色譜柱的理論板數(shù)(n )、分離度、重復性、拖尾因子的測定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法（通則0512）項下方法，但在高分子雜質(zhì)檢査時，某些藥物分子的單體與其二聚體不能達到基線分離時，其分離度公式如下，除另有規(guī)定外，分離度應大于2 .0。

中國藥典中常用色譜方法中的系統(tǒng)適用性試驗參數(shù)

通則	系統(tǒng)適用性試驗參數(shù)
0512高效液相色譜法	理論板數(shù)（n）、分離度（R）、靈敏度、拖尾因子、重復性（RSD%）
0502薄層色譜法	比移值（Rf）、檢出限、分離度、RSD%
0513離子色譜法	同高效液相色譜法
0514分子排阻色譜法	同高效液相色譜法，特殊情況可以用分離度表示（同峰谷比）
0521氣相色譜法	同高效液相色譜法
0531超臨界流體色譜法	同高效液相色譜法
0532臨界點色譜法	同高效液相色譜法

 

2、USP 621色譜法中的規(guī)定

USP 621色譜法中規(guī)定的系統(tǒng)適用性評價參數(shù)包括：分離度、對稱因子、重復性、信噪比、理論板數(shù)，還有Peak-to-Valley Ratio (p/v)峰谷比（計算公式為p/v = Hp/Hv）。

3、EP 2.2.46色譜分離技術(shù)中的規(guī)定

EP 2.2.46色譜分離技術(shù)中規(guī)定的系統(tǒng)適用性評價參數(shù)與USP基本一致，包括：分離度、對稱因子、重復性、信噪比、理論板數(shù)、Peak-to-Valley Ratio (p/v)峰谷比（計算公式為p/v = Hp/Hv）。

通過比較可見，USP、EP中規(guī)定的系統(tǒng)適用性參數(shù)與ChP基本一致，但USP、EP中有峰谷比，ChP僅在分子排阻色譜法中提到了一個與峰谷比相同的分離度，在其他色譜法中沒有這個規(guī)定?？傮w來看，歐美藥典的規(guī)定要比中國藥典細致，在具體品種的標準中，歐美藥典也很重視系統(tǒng)適用性試驗。 

系統(tǒng)適用性試驗是為了保證方法重現(xiàn)性和準確度，一個方法中的系統(tǒng)適用性溶液如何配制、如何規(guī)定，都與具體的檢測方法、檢測目的、檢測樣品有關。不同方法和不同的目的會有不同的系統(tǒng)適用性要求，例如梯度、等度、含量測定、有關物質(zhì)等，對應系統(tǒng)適用性試驗一般就不同；不同來源的樣品，由于其處方和生產(chǎn)工藝、雜質(zhì)譜分布可能不同，系統(tǒng)適用性試驗的設計也可能完全不同。 

對于有關物質(zhì)方法而言，如果缺少系統(tǒng)適用性要求，就很難保證方法的重現(xiàn)性，特別是在色譜柱等重要信息未在標準中明確規(guī)定的情況下就更難重現(xiàn)了，即使重現(xiàn)了，也可能出現(xiàn)樣品中個別雜質(zhì)順序出現(xiàn)不同的情況。系統(tǒng)適用性試驗不是一個孤立的試驗，受很多參數(shù)的影響，雖然ChP2020通則9101沒有說明系統(tǒng)適用性試驗該如何研究和驗證，但在方法開發(fā)、優(yōu)化、方法學驗證、方法轉(zhuǎn)移、方法使用的過程中都應該去結(jié)合具體品種和具體方法去設計。目前系統(tǒng)適用性試驗該如何規(guī)定、如何進樣，還未見有官方的規(guī)定。

 

二、系統(tǒng)適用性試驗的設計

盡管沒有官方規(guī)定，但是我們可以參考歐美藥典中的一些設計做一些分析和思考，以常用的HPLC法、GC法為例：

1、含量測定

采用外標法時，通常取對照品溶液連續(xù)進樣5次，RSD應不大于2.0%。ChP規(guī)定采用內(nèi)標法時，通常配制相當于80%、100%、120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其RSD應不大于2.0%。但有些USP品種（如奧美沙坦酯），采用內(nèi)標法時，系統(tǒng)適用性評價采用對照品溶液（含內(nèi)標），評價指標為主成分與內(nèi)標物的分離度，以及二者峰面積比值的RSD，小于0.5%。說明內(nèi)標法測定含量時也可以采用外標法的思路進行，研究中可以與藥典中配制高中低三份溶液的規(guī)定對比，如果經(jīng)過研究和驗證二者都可以保證結(jié)果的準確度與精密度，是可以考慮突破藥典規(guī)定的。通過多個品種的比較發(fā)現(xiàn)，USP含量測定中RSD幾乎是都有的，而理論板數(shù)則使用的較少，而中國藥典中有些品種項下只規(guī)定了一個理論板數(shù)應大于XXX，而這可能僅僅是一個虛的指標，應該提高標準。

2、殘留溶劑

對于氣相色譜法測定殘留溶劑，USP標準中采用內(nèi)標法測定，其系統(tǒng)適用性評價指標為待測物與內(nèi)標物的分離度，以及二者峰面積比值的RSD，例如小于5.0%。這說明，當待測成分是微量或痕量時，進樣量少或色譜峰響應值較小時，對RSD的要求可以適當放寬。

3、有關物質(zhì)

USP中采用主成分外標法測定雜質(zhì)的比較多，即配制一定濃度的主成分對照品溶液，以此計算每一個雜質(zhì)的含量，有時也包括加相對響應因子的主成分外標法。此時系統(tǒng)適用性要求一般考察對照品溶液峰面積的RSD，如不得過2.0%，也有的規(guī)定不得過10%（如USP瑞格列奈），這些限度都是經(jīng)過大量研究和驗證的，目的是保證進樣的精密度和準確度。

以阿奇霉素為例，ChP2010有關物質(zhì)中沒有系統(tǒng)適用性溶液，只有靈敏度溶液，但是ChP2015中增加了系統(tǒng)適用性溶液，規(guī)定靈敏度溶液主峰信噪比應大于10，系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中各峰之間的分離度均應大于1.2，阿奇霉素峰的保留時間應在30~40min之間。系統(tǒng)適用性溶液不但起到了保證雜質(zhì)分離度的作用，而且在后期歸屬的時候也能夠準確對雜質(zhì)進行歸屬?？墒牵⑵婷顾叵到y(tǒng)適用性對照品在中檢院國家藥品標準物質(zhì)查詢與訂購平臺卻查不到、買不到，說明對照品對質(zhì)量標準之間還存在很多問題。

沒有混合對照品怎么辦？目前，含多個雜質(zhì)的系統(tǒng)適用性溶液配制方法有很多種，例如分別用雜質(zhì)對照品配制、一部分用雜質(zhì)對照品一部分用主成分降解、將多個雜質(zhì)與主成分混合均勻配成均一的混合物、將多個雜質(zhì)與主成分溶解后蒸干制成混合物、使用經(jīng)過定性研究過的代表性的粗品、購買EP、BP、USP的混合對照品/峰鑒別對照品等，研究中可以根據(jù)方法和品種特點進行選擇。

例如瑞格列奈有關物質(zhì)檢查項下就規(guī)定：取供試品溶液，置 90℃水浴加熱24小時，放冷，取20µl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，瑞格列奈峰保留時間約為22min，在相對瑞格列奈峰保留時間約為 1.1處應出現(xiàn)雜質(zhì)峰，該雜質(zhì)峰與瑞格列奈峰的分離度應符合要求。

如果主峰前后存在一個難分離的雜質(zhì)，那么在有關物質(zhì)系統(tǒng)適用性設計時應采用外標法或降解法配制系統(tǒng)適用性溶液，例如濃度可以為供試品濃度+雜質(zhì)限度濃度或幾倍雜質(zhì)限度濃度的溶液，來考察保證重現(xiàn)性和準確性。

4、溶出度

USP鹽酸二甲雙胍片溶出度方法3中的系統(tǒng)適用性規(guī)定對照品溶液的拖尾因子不得過2.0、理論板數(shù)不低于1500，RSD不得過2.0。這個例子說明在如此大濃度的樣品檢測時，容易出現(xiàn)較大的拖尾，甚至理論板數(shù)下降的情況，但是即使拖尾因子不在常規(guī)的0.95~1.05或0.8~1.5范圍內(nèi)，理論板數(shù)不在常規(guī)的2000以上，只要結(jié)果準確度和精密度不受影響，也能夠滿足檢測要求。所以系統(tǒng)適用性是與檢測目的和檢測樣品有關的，不能千篇一律。

5、異構(gòu)體

如果采用外標法測定，USP標準（如瑞格列奈）采用與供試品溶液相同濃度以及10倍異構(gòu)體限度濃度配制了系統(tǒng)適用性溶液（混合溶液），同時配制了限度濃度的對照品溶液。系統(tǒng)適用性試驗中規(guī)定異構(gòu)體對主峰的相對保留時間約為1.5、分離度應不低于1.5、以及對照品溶液的RSD不得過5.0%。說明采用外標法定量時對照品溶液的RSD是重點考察指標，分離度是專屬性的保證，而且加上相對保留時間作為對比，進一步提高了方法的重現(xiàn)性。通常我們可能認為既然已經(jīng)規(guī)定了4.0mm×100cm，5µm的L41色譜柱，就沒有必要增加1.5的相對保留時間了，但是USP還是增加了這一條，說明在提高方法重現(xiàn)性和準確性方面我們還需要向USP學習這種理念。

三、總結(jié)

USP對分析方法系統(tǒng)適用性的重視已經(jīng)引起了行業(yè)內(nèi)人員的關注，對分析方法而言，系統(tǒng)適用性試驗非常重要。在一個分析方法建立后，以后會在不同人員、不同儀器、不同時間、不同實驗室、各種不同情況下被使用，可能會出現(xiàn)各種異?；蛘咂?。那么如何減少這種情況呢？在方法研究的過程中開展系統(tǒng)適用性試驗研究，我想是可能一種有效的方法。 

一旦方法中包括了系統(tǒng)適用性試驗，就一定要在樣品檢測時進行這個試驗，不能忽視，認為可有可無。例如，在2019年國家局飛檢中就常見“檢測前未進行色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗”的缺陷。系統(tǒng)適用性試驗已經(jīng)是GMP檢查的一部分。 

如果系統(tǒng)適用性試驗按照方法中規(guī)定的參數(shù)去做達不到要求時該如何進行色譜參數(shù)的調(diào)整呢？

ChP2020版藥典（征求意見稿）0512高效液相色譜法中首次公開了具體色譜參數(shù)允許調(diào)整范圍，這些參數(shù)參考了EP 2.2.46和USP 621，是一個很大的進步。相信隨著這些通則內(nèi)容的不斷完善，關于系統(tǒng)適用性試驗中相關的參數(shù)調(diào)整內(nèi)容會更有依據(jù)。

在參考EP、USP標準進行方法研究時，注意不能脫離其他色譜參數(shù)而去考察系統(tǒng)適用性，例如首先要關注色譜柱使用是否正確，如果不正確，系統(tǒng)適用性是很難滿足要求的。在EP、USP標準中往往都規(guī)定了色譜柱的規(guī)格，在使用標準可以先通過EDQM中的Knowledge Database以及USP色譜柱數(shù)據(jù)庫進行色譜柱的檢索。

如果在方法學驗證中發(fā)現(xiàn)不同儀器、不同試劑、不同流速、不同pH、不同柱溫、不同離子對試劑、不同衍生化試劑等這些參數(shù)對方法的系統(tǒng)適用性有影響，那么應在方法中進行規(guī)定或說明，以保證以后方法使用時的重現(xiàn)性和準確性。

EP和USP雜質(zhì)檢查方法中，常見采用峰谷比進行系統(tǒng)適用性描述的，峰谷比通常在質(zhì)量標準的有關物質(zhì)檢查中當兩個峰（例如主峰與相鄰雜質(zhì)峰）基線無法分離時使用，限度目前沒有統(tǒng)一規(guī)定。根據(jù)ChP2015通則0514分子排阻色譜法中的系統(tǒng)適用性項下的分離度公式可知，這里的分離度（R）相當于歐美藥典中的峰谷比Peak-to-Valley Ratio (p/v)，只是中國藥典中尚沒有峰谷比的概念，作者認為在ChP2020版可以考慮加入這個概念。如果在系統(tǒng)適用性試驗中規(guī)定峰谷比，應進行詳細的描述，目前還不宜直接說峰谷比。例如：雜質(zhì)X的峰高（Hp，從基線至雜質(zhì)X峰的最高點）與雜質(zhì)X和XXX兩峰之間的峰谷（Hv，從基線至兩峰之間的最低點）之比（Hp/Hv）不得低于XX。 

EP、USP在質(zhì)量標準撰寫形式、細節(jié)規(guī)定、系統(tǒng)適用性試驗方面值得我們學習和借鑒，相信隨著ChP2020等技術(shù)指導性文件的不斷完善，分析方法一定能夠越來越嚴謹、越來越科學、越來越能有好的重現(xiàn)性和準確性。