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嘉峪檢測網(wǎng) 2020-04-22 20:08
眾所周知，藥物的鑒別試驗在藥物研發(fā)、藥物檢測中有著不可小覷的重要地位。只有在藥物鑒別無誤的情況下，進行藥物的雜質檢查、含量測定等分析才有意義。
藥物的鑒別試驗是根據(jù)藥物的分子結構、理化性質，采用物理、化學或生物學方法來判斷藥物的真?zhèn)?。鑒別項下規(guī)定的試驗方法，僅適用于鑒別藥物的真?zhèn)?；對于原料藥，還應結合性狀項下的外觀和物理常數(shù)進行確認。
一、性狀反映藥物特有的物理性質
1.外觀：是對指藥品的色澤和外表感觀的規(guī)定，包括藥品的聚集狀態(tài)、晶型、色澤以及臭、味等性質。
2.溶解度：在一定程度上反映了藥品的純度、晶型或粒度，也可供精制或制備溶液時參考。藥品的溶解度不合格，提示其純度、晶型或粒度可能存在問題。一個化合物的表觀溶解度是由其組成的各個成分溶解度的加權和。盡管其含量測定可能合格，但溶解度的不合格提示了其中的一個或幾個比較大的相關雜質影響其表觀溶解行為。另外，溶解度不合格，也可能是由藥品的晶型或粒度的差異造成的。
例如：小編得知某企業(yè)在做羅紅霉素膠囊工藝處方研究試驗時發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的羅紅霉素原料，對羅紅霉素膠囊制劑溶出度影響不同，后經(jīng)過試驗證實：原料藥粒度不同是溶出度結果存在差異的主要原因。
3.物理常數(shù)：是評價藥品質量的主要指標之一，如相對密度、餾程、熔點、凝點、比旋度、折光率、黏度、吸收系數(shù)、碘值、皂化值、酸值等。
二、一般鑒別試驗
1.包括：有機氟化物、有機酸鹽、芳香第一胺類、托烷生物堿類、無機金屬鹽（鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋇鹽的焰色反應、銨鹽）、無機酸根（氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽）。
其中，有機氟化物：取供試品約7mg，照氧瓶燃燒法進行有機破壞，用水20ml與0.01mol/L氫氧化鈉溶液6.5ml為吸收液，使燃燒完全后，充分振搖，取吸收液2ml，加茜素氟藍試液0.5ml。再加12%醋酸鈉的稀醋酸溶液0.2ml。用水稀釋至4ml，加硝酸亞鈰試液0.5ml，即顯藍紫色，同時作空白對照試驗。
有機酸鹽：水楊酸鹽，取供試品的稀溶液，加三氯化鐵試液1滴，即顯紫色。
酒石酸鹽，取供試品的中性溶液，置潔凈的試管中，加氨制硝酸銀試液數(shù)滴，置水浴中加熱，銀即游離并附在試管的內壁成銀鏡。
三、專屬鑒別試驗
藥物的專屬鑒別試驗是證實某一種藥物的依據(jù)，它是根據(jù)每一種藥物化學結構的差異及其所引起的物理化學特性不同，選用某些特有的靈敏的定性反應，來鑒別藥物的真?zhèn)巍?/span>
四、鑒別方法
1.化學鑒別法
具有反應迅速、現(xiàn)象明顯的特點才有實用價值，至于反應是否完全則不是主要的。
1.1呈色反應鑒別法：供試品溶液中加入適當?shù)脑噭?，在一定條件下進行反應，生成易于觀測的有色產(chǎn)物。
1.2沉淀生成反應鑒別法：供試品溶液中加入適當?shù)脑噭┤芤?，在一定條件下進行反應，生成不用顏色的沉淀，有的具有特殊的沉淀形狀。
1.3熒光反應鑒別：在適當?shù)娜軇┲兴幬锉旧砜稍诳梢姽庀掳l(fā)射熒光，如硫酸奎寧的稀硫酸溶液顯藍色熒光。
1.4氣體生成反應鑒別法：大多數(shù)的胺類藥物、酰脲類藥物以及某些酰胺類藥物可經(jīng)強堿處理后加熱產(chǎn)生氨氣；含碘有機藥物經(jīng)直火加熱可生成紫色碘蒸氣（碘甘）等。
1.5使試劑褪色的鑒別法：如維生素C的二氯靛酚反應；氧烯洛爾的高錳酸鉀反應等。
1.6測定生成物的熔點：費事費時，應用較少。
2.光譜鑒別法
2.1紫外光譜鑒別法（UV）：多數(shù)的有機藥物分子中含有能吸收紫外可見光的基團而顯特征吸收光譜，可作為鑒別的依據(jù)，但因吸收光譜較為簡單，曲線形狀變化不大，用作鑒別的專屬性遠不如紅外光譜。
2.2紅外光譜鑒別法(IR)：專屬性很強、應用廣泛的鑒別方法。主要用于組分單一、結構明確的原料藥，特別適合于用其他方法不易區(qū)分的同類藥物，如磺胺類、甾體激素類和半合成抗生素類藥品。
2.3近紅外光譜法(NIR)：通過測定被測物質在近紅外光譜區(qū)750-2500mm
的特征光譜并利用適宜的化學計量學方法提取相關信息后，對被測物質進行定性、定量分析的一種分析技術。
2.4原子吸收法：利用原子蒸氣可以吸收由該元素作為陰極燈的空心陰極燈發(fā)出的特征譜線的特性，根據(jù)供試溶液在特征譜線處的最大吸收和特征譜線的強度減弱程度可以進行定性、定量分析。
2.5核磁共振法(NMR)：利用原子核的物理性質，采用當代先進的電子和計算機技術，用于各種分子物理和化學結構的研究。
2.6質譜鑒別法(MS)：將被測物質離子化后，在高真空狀態(tài)下按離子的質荷比大小分離，而實現(xiàn)物質成分和結構分析的方法。
3.色譜鑒別法
利用不同物質在不同色譜條件下，產(chǎn)生各自的特征色譜行為進行的鑒別試驗。采用與對照品在相同條件下進行色譜分離，并進行比較，根據(jù)兩者保留行為和檢測結果是否一致來驗證藥品的真?zhèn)?。此方法操作比價費時。
3.1薄層色譜鑒別法（TLC）：
在ChP2015中，對薄層色譜鑒別法在斑點的顏色、位置與斑點大小方面做出了明確要求：①供試品溶液和對照標準溶液，在同一報層板上點樣、展開與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點的位置和顏色（或熒光）應與標準物質色譜圖的斑點一致；
②必要時化學藥品可采用供試品溶液與對照標準溶液混合點樣、展開，與標準物質相應斑點應為單一、緊密斑點；
③選用與供試品化學結構相似藥物對照品或雜質對照品，兩者的比移值（Rf）應不同（如潑尼松龍與氫化可的松）；上述兩種溶液等體積混合，應顯兩個清晰分離的斑點。
注意事項：由于受到薄層板質量、邊緣效應等因素的影響，實際操作中有時會遇到同一物質在同一塊薄層板上的Rf值不一的情況，操作中可增加將供試品溶液與對照品溶液等量混合，點樣后出現(xiàn)單一斑點作為鑒別依據(jù)。
3.2高效液相色譜和氣相色譜鑒別法
一般規(guī)定按供試品含量測定項下的色譜條件進行試驗。要求供試品和對照品色譜峰的保留時間應一致；例如，維生素E的GC鑒別和復方磺胺甲惡唑片中兩主成分的HPLC鑒別。含量測定方法為內標法時，也可要求供試品溶液和對照品溶液色譜圖中藥物峰的保留時間與內標物峰的保留時間比值應相一致。
采用HPLC和GC鑒別法時應注意，色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性要好，同一物質不同時間進樣的保留時間重現(xiàn)性必須有保證。在實際操作中，由于條件不明原因的微小變化，有時候存在同一物質在表面完全相同的色譜系統(tǒng)中保留時間不一致的情況，尤其梯度洗脫時此種現(xiàn)象更為常見。
3.3 顯微鑒別法
顯微鑒別主要用于中藥及其制劑的鑒別，通常采用顯微鏡對藥材的切片、粉末、解離組織或表面制片，以及含飲片粉末的制劑中飲片的組織、細胞或內含物等特征進行鑒別的一種方法。鑒別時選擇有代表性的供試品，根據(jù)各品種鑒別項的規(guī)定制片。制劑根據(jù)不同劑型適當處理后制片。
例如，何首烏的橫切面、粉末顯微鑒別圖像如下。
3.4 生物學法
利用藥效學和分子生物學等有關技術來鑒定藥物品質的一種方法，主要用于抗生素、生化藥物以及中藥的鑒別，通常分為生物效應鑒別法和基因鑒別法兩大類。按照鑒定的目的和對象不同，也可分為免疫鑒別法、細胞生物學鑒別法、生物效價測定法、純指標測定法、DNA遺傳標記鑒別法、mRNA差異顯示鑒別法等。
3.5 指紋圖譜與特征圖譜鑒別法
中藥指紋圖譜建立的目的是通過對所得到的能夠體現(xiàn)中藥整體特性的圖譜識別，提供一種能夠比較全面地控制中藥質量的方法，從化學物質基礎的角度保證中藥制劑的穩(wěn)定和可靠。其具體時間是采用指紋圖譜模式，將中藥內在物質特性轉化為常規(guī)數(shù)據(jù)信息，用于中藥鑒別和質量評價。
例如，刺五加浸膏特征圖譜如下：
五、鑒別試驗的條件及方法驗證
鑒別試驗的目的是判斷藥物的真?zhèn)危运捎玫幕瘜W反應或物理特性產(chǎn)生的明顯的易于覺察的特征變化為依據(jù)，因此，鑒別試驗必須在規(guī)定條件下完成，否則將會影響結果的判斷。影響鑒別反應的因素主要有被測物濃度、試劑的用量、溶液的溫度、pH、反應時間和干擾物質等。
5.1 溶液的濃度：在鑒別試驗中加入的各種試劑一般是過量的，溶液的濃度主要是指被鑒別藥物的濃度。鑒別試驗多采用觀察沉淀、顏色或測定各種光學參數(shù)的變化來判定結果，藥物的濃度直接影響上述參數(shù)的變化，必須嚴格規(guī)定。
5.2溶液的溫度：溫度對化學反應的影響很大，一般溫度每升高10℃，可使反應速度增加2-4倍。但溫度升高使得化合物分解，導致顏色變淺，甚至觀察不到陽性結果。
5.3溶液的酸堿度：許多鑒別試驗反應都是需要在一定酸堿度的條件下才能進行。
5.4試驗時間：有機化合物的化學反應和無機化合物不同，一般反應速度較慢，達到預期試驗結果需要較長時間。是因為有機化合物是以共價鍵相結合，化學反應能否進行，依賴于共價鍵的斷裂和新鍵形成的難易，這些價鍵的更替需要一定的反應時間和條件。
5.5鑒別方法的驗證：因為鑒別的目的是判定被分析物是目標化合物，而非其他物質，因此用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性。鑒別試驗一般需要對方法的專屬性和耐用性進行驗證。
5.5.1專屬性：是指其他成分存在的情況下，采用鑒別方法能否正確地鑒別出被測物質的特性。
5.5.2耐用性：在測定條件發(fā)生小的變動時，測定結果受到的影響程度。如色譜柱型號、pH值等。
鑒別試驗是藥品質量檢測工作中的首項任務，適用于未知化合物的鑒別或目標對象的結構確認。
來源：藥研
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