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本文旨在對(duì)定量限驗(yàn)證的過(guò)程中一些常見(jiàn)的不符合預(yù)期的情況如信噪比不穩(wěn)定、回收率不符合規(guī)定等現(xiàn)象進(jìn)行分析，以及由這些現(xiàn)象引出的定量限測(cè)不準(zhǔn)原理。

中國(guó)藥典2015年版四部通則9101對(duì)定量限概念的定義為：“定量限系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。對(duì)微量或痕量藥物分析、定量測(cè)定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)確定方法的定量限……一般以信噪比為10:1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。”這一概念為目前定量限的主流定義，ICH與歐美日等各國(guó)相關(guān)指導(dǎo)原則對(duì)定量限定義都與此大致相同。

上述概念對(duì)方法驗(yàn)證中定量限驗(yàn)證的做法有著重要的影響，定量限驗(yàn)證的做法在近些年也發(fā)生了許多的變化，如早期主要的工作在于確認(rèn)信噪比10的各組分濃度，演變?yōu)槎肯抟残枰疾祉憫?yīng)情況的精密度，直至目前主流的定量限還需要考察回收率的結(jié)果。

隨著定量限驗(yàn)證內(nèi)容的增加，定量限驗(yàn)證過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題也越來(lái)越多，具體驗(yàn)證的做法也逐漸發(fā)生了變化，下面的章節(jié)討論驗(yàn)證過(guò)程中出現(xiàn)的各種問(wèn)題與由此引起的定量限驗(yàn)證具體做法的變化。

如上文所述在早期（如十年前）的方法驗(yàn)證中，定量限驗(yàn)證僅要求確認(rèn)信噪比為10的各組分濃度，后來(lái)逐漸增加了考察信噪比為10的各組分定量限濃度下的響應(yīng)情況的精密度研究。由此必然會(huì)引入一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)，即樣品濃度一致信號(hào)響應(yīng)大致相同，但是不能確保每次進(jìn)樣的噪音都完全一致，遂出現(xiàn)信噪比在10附件波動(dòng)的情況，可能某一次或數(shù)次信噪比小于10，不符合相關(guān)指導(dǎo)原則對(duì)定量限的定義“一般以信噪比為10:1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限”。

由于上述情況的出現(xiàn)，引起了許多人對(duì)定量限概念的思考，該階段的思考主要在以下幾個(gè)問(wèn)題：

1、信噪比能說(shuō)明什么？--定量限測(cè)不準(zhǔn)原理

信噪比，顧名思義，就是組分響應(yīng)信號(hào)與基線(xiàn)噪音的比值。我們都知道，液相色譜的響應(yīng)值并不是一個(gè)固定值，會(huì)隨著儀器狀態(tài)（如氘燈能量）、不同品牌型號(hào)等差異導(dǎo)致響應(yīng)信號(hào)不同；基線(xiàn)噪音也是如此，不同流動(dòng)相、不同日期、不同儀器、不同類(lèi)型檢測(cè)器、同一臺(tái)儀器不同狀態(tài)等都會(huì)導(dǎo)致噪音的值存在明顯的差異。通過(guò)以上分析可知，信噪比是一個(gè)隨機(jī)的不確定的值，那么這個(gè)值到底能說(shuō)明什么問(wèn)題？

上面的問(wèn)題很難回答，但是有一點(diǎn)能確定，即方法驗(yàn)證過(guò)程中找出來(lái)的信噪比10的濃度的溶液，換一臺(tái)儀器或者換流動(dòng)相等參數(shù)，信噪比就極大可能不是10了，這是個(gè)幾乎不能重現(xiàn)的結(jié)果。換個(gè)角度分析，也可以說(shuō)信噪比10的溶液濃度是不確定的。由此我們可以得出一個(gè)原理，即定量限測(cè)不準(zhǔn)原理，該原理可以表述為以下的形式：以信噪比10為某個(gè)組分的定量限，則其濃度是不確定的；以某個(gè)確定的濃度為定量限，則其信噪比不一定總是10；即信噪比10與濃度二者必有一個(gè)是不確定的。

2、定量限的信噪比必須是10嗎？

由于定量限測(cè)不準(zhǔn)原理，越來(lái)越多的人在質(zhì)疑定量限信噪比10的規(guī)定的合理性，于是許多人逐漸摒棄了定量限信噪比10的規(guī)定，但是這些人中分出兩個(gè)主要的群體：一部分人有限摒棄該規(guī)定，具體做法是配制某個(gè)濃度（一般為限度的1/n，n≥2），在這個(gè)濃度下信噪比大于10，但是也不能偏離太多，一般不大于100；另一部分人為徹底摒棄，具體做法是配制某個(gè)濃度（一般為限度的1/n，n≥2），在這個(gè)濃度下信噪比大于10即可，以確認(rèn)方法有足夠的靈敏度。

到目前為止，仍然有許多同仁陷在定量限信噪比10的坑里沒(méi)爬出來(lái)，我想對(duì)這些同仁說(shuō)：“我們的軀體可以被束縛，但是思想不能被禁錮。”

3、 定量限為試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，找出這個(gè)值有意義嗎？

提供雜質(zhì)檢測(cè)的結(jié)果時(shí)，結(jié)果的接收方一般不關(guān)注方法能檢出的最低量，大多數(shù)只關(guān)注實(shí)測(cè)值或者是否超過(guò)限度，因此在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，報(bào)告的雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果小于一定的值之后就很可能沒(méi)有了意義，如原料藥有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果，某雜質(zhì)限度為0.1%，報(bào)告的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果為“0.0003%”與“小于0.02%”并沒(méi)有實(shí)際上的差別，都足以讓結(jié)果的接受方得出供試品中該雜質(zhì)含量遠(yuǎn)低于限度要求的判斷。因此ICH的相關(guān)指導(dǎo)原則中提出了報(bào)告限的概念，含量低于報(bào)告限的雜質(zhì)在檢測(cè)結(jié)果中可以不必報(bào)告具體檢測(cè)值，如果遵循ICH相關(guān)指導(dǎo)原則的規(guī)定，確認(rèn)分析方法在報(bào)告限濃度水平具有良好的靈敏度、精密度與準(zhǔn)確度就足以滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)需要。

由于定量限測(cè)不準(zhǔn)原理的存在，被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量在實(shí)際檢測(cè)工作中是不穩(wěn)定的隨機(jī)的值，因此方法驗(yàn)證中確定該值并無(wú)太大的實(shí)質(zhì)上的意義。

一般來(lái)說(shuō)，沒(méi)有必要確定定量限，但是在某些情況下如藥代動(dòng)力學(xué)研究過(guò)程中，待測(cè)樣品的含量可能是一個(gè)非常大的區(qū)間，對(duì)儀器與分析方法的定量限研究對(duì)于相關(guān)研究具有一定的指導(dǎo)意義，因此具有一定的積極意義，但仍然要充分評(píng)估各種條件變動(dòng)對(duì)該值變化存在的風(fēng)險(xiǎn)。

最近逐漸興起定量限需要做準(zhǔn)確度驗(yàn)證的做法，中國(guó)藥典2015年版四部通則9101對(duì)定量限概念的定義中明確提出定量限“其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求”，于是越來(lái)越多的人開(kāi)始進(jìn)行定量限濃度的回收率試驗(yàn)。

定量限濃度的回收率試驗(yàn)一般濃度小響應(yīng)誤差大，回收率經(jīng)常不符合規(guī)定，這屬于正常情況，可以理解；但是正常歸正常理解歸理解，可不符合規(guī)定就不符合指導(dǎo)原則要求的“測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度要求”的定義，應(yīng)該怎么處理呢？

1、放寬定量限回收率的可接受標(biāo)準(zhǔn)

以有關(guān)物質(zhì)方法驗(yàn)證為例，如果其他三個(gè)濃度水平的回收率可接受標(biāo)準(zhǔn)為80%~120%，則將定量限回收率可接受標(biāo)準(zhǔn)放寬至70%~130%；這是目前較為常見(jiàn)的一類(lèi)做法，是上文中提到的未徹底摒棄信噪比10規(guī)定的同仁較常見(jiàn)的做法，似乎非常合理，定量限響應(yīng)低誤差大，所以回收率相對(duì)放寬，很合理。但是…..事情總是有但是，從檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度角度來(lái)看，是否可以認(rèn)為定量限濃度水平的檢測(cè)結(jié)果較其他濃度水平的檢測(cè)結(jié)果更加不準(zhǔn)確？對(duì)于檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的要求可以這樣隨意更改嗎？那以后定量限水平的檢測(cè)結(jié)果是可信還是不可信？

如果深究的話(huà)，似乎放寬定量限回收率的做法也有一定的問(wèn)題，而且這種放寬是非常隨意沒(méi)有什么依據(jù)的做法，由于該做法存在以上的矛盾，所以又有了另一種做法，如下：

2、提高定量限濃度

既然是由于濃度小響應(yīng)誤差大導(dǎo)致回收率不符合規(guī)定，那么提高定量限濃度也就增加了響應(yīng)減小了檢測(cè)誤差，則可避免由此導(dǎo)致的回收率不符合規(guī)定的情況。這種做法常見(jiàn)于上文提到的徹底摒棄信噪比10規(guī)定的同仁，定量限水平的回收率可接受標(biāo)準(zhǔn)同其他濃度水平，即其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度同其他濃度水平。

該種做法的出現(xiàn)，可以說(shuō)標(biāo)志著定量限的概念已經(jīng)千瘡百孔、名存實(shí)亡。為什么這么說(shuō)？因?yàn)樵谠摑舛认碌男旁氡瓤赡芤呀?jīng)達(dá)到了好幾百，遠(yuǎn)大于指導(dǎo)原則中對(duì)于信噪比10的要求，這個(gè)濃度與定量限還有多大的關(guān)系？只是以定量限的名義對(duì)方法的靈敏度是否符合檢測(cè)要求的一次確認(rèn)而已。于是筆者有了一個(gè)大膽的想法：

這種聳人聽(tīng)聞的觀念應(yīng)該會(huì)產(chǎn)生很大的沖擊，一定會(huì)有許多同仁不能接受，畢竟存在了這么多年深入人心的定量限概念，筆者竟敢信口開(kāi)河說(shuō)要徹底放棄，俗語(yǔ)說(shuō)癩蛤蟆打哈欠—恁大的口氣！如果上文的內(nèi)容還不足以說(shuō)明定量限概念的不合時(shí)宜，筆者下文將會(huì)給出對(duì)定量限的致命一擊。

定量限概念的不嚴(yán)謹(jǐn)與局限性，給實(shí)踐帶來(lái)了各種各樣的困擾，上述驗(yàn)證的各種問(wèn)題只是其中一個(gè)方面，另一個(gè)方面體現(xiàn)在日常檢測(cè)工作中。定量限概念中要求“其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求”，這句話(huà)的本意是低于定量限的結(jié)果準(zhǔn)確度與精密度皆不可知，從嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度出發(fā)，日常檢測(cè)過(guò)程中，低于定量限的檢測(cè)結(jié)果不應(yīng)被出示，也就是說(shuō)如果某組分的實(shí)測(cè)結(jié)果小于定量限，在COA中不得出現(xiàn)數(shù)值的表現(xiàn)形式，而應(yīng)表達(dá)為“小于定量限”。該要求有其先進(jìn)性，但是它的局限性在于定量限測(cè)不準(zhǔn)，也就是說(shuō)日常檢測(cè)過(guò)程中不能知道定量限的具體值?；蛟S有同仁會(huì)反駁說(shuō)，QC實(shí)驗(yàn)室在做方法轉(zhuǎn)移或者方法確認(rèn)時(shí)會(huì)驗(yàn)證定量限，同上文所述，方法轉(zhuǎn)移或者方法確認(rèn)的定量限數(shù)據(jù)能適用所有的狀態(tài)嗎？

結(jié)合以上兩種情況，我們已經(jīng)知道定量限的概念對(duì)驗(yàn)證與日常檢測(cè)都帶來(lái)了無(wú)法逾越的障礙，所以它必須被徹底放棄，我們不提定量限不管信噪比10，我們只研究方法能達(dá)到的風(fēng)險(xiǎn)較低的具有準(zhǔn)確度與精密度的最低允許的檢測(cè)結(jié)果，即方法的靈敏度應(yīng)當(dāng)符合要求。以有關(guān)物質(zhì)為例，如果某個(gè)組分的限度為0.1%，如果0.02%水平下在響應(yīng)最差的儀器中信噪比仍然達(dá)到100，且回收率驗(yàn)證與精密度驗(yàn)證均符合規(guī)定，則可以認(rèn)為該數(shù)字可以適用于今后的日常檢測(cè)，即如果有小于0.02%的檢測(cè)結(jié)果，在COA中表述為“小于0.02%”，如果方法中規(guī)定了報(bào)告限或遵循ICH相關(guān)指導(dǎo)原則中報(bào)告限的規(guī)定，且0.02%小于報(bào)告限，也可表述為“小于報(bào)告限”。

如果方法的靈敏度存在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)當(dāng)在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中增加靈敏度的相關(guān)試驗(yàn)。以有關(guān)物質(zhì)為例，如某組分的限度0.1%，方法驗(yàn)證時(shí)0.05%水平下信噪比20，回收率驗(yàn)證與精密度驗(yàn)證均符合規(guī)定，該水平為日常檢測(cè)報(bào)告的最低值，則在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中應(yīng)確認(rèn)該組分0.05%水平下信噪比不小于20。

方法的全生命周期的過(guò)程需要伴隨知識(shí)管理的過(guò)程，如上文所述在方法驗(yàn)證期間確認(rèn)的日常檢測(cè)最低報(bào)告值需要由方法驗(yàn)證的負(fù)責(zé)人傳遞至QC相關(guān)人員。

限于經(jīng)驗(yàn)及知識(shí)的限制，筆者所述未必正確，如睿智的讀者有其他觀點(diǎn)，歡迎指點(diǎn)迷津。

如果各位讀者在方法驗(yàn)證中有其他的異常情況，也歡迎分享，筆者會(huì)收集相關(guān)內(nèi)容并進(jìn)行原因分析。拜謝！