摘要：
目的：進(jìn)一步提高完善雞血藤飲片的質(zhì)量控制方法，為其綜合質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。方法：在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化薄層鑒別方法，同時(shí)采用HPLC法對本品所含化學(xué)成分進(jìn)行指紋圖譜研究，并對其主要成分兒茶素和表兒茶素進(jìn)行含量測定研究。
結(jié)果：15批雞血藤飲片標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果顯示水分為6.62%~12.51%，總灰分為2.10%~3.25%，醇溶性浸出物為8.08%~10.02%。TLC優(yōu)化方法顯示樣品斑點(diǎn)清晰，分離良好，且能夠區(qū)分正偽品。15批樣品HPLC（UV 260 nm）指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果為0.84~0.99，并經(jīng)對照品比對確認(rèn)10個(gè)共有峰（沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素和芒柄花素）；同時(shí)所建立指紋圖譜能夠鑒別偽品。HPLC（UV 202 nm）含量測定結(jié)果顯示，15批樣品中兒茶素與表兒茶素含量分別為0.039%~0.068%、0.12%~0.23%，以表兒茶素含量整體較高，可作為含量測定指標(biāo)。結(jié)論：建立的方法能夠用于雞血藤飲片的整體質(zhì)量控制與評價(jià)。
雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖。秋、冬二季采收，除去枝葉，切片，曬干。具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)之功效，用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)，經(jīng)閉，風(fēng)濕痹痛，麻木癱瘓，血虛萎黃[1]。雞血藤化學(xué)成分復(fù)雜，藥理活性多樣，作為一種傳統(tǒng)的活血補(bǔ)血中藥，藥用歷史久遠(yuǎn)，大量應(yīng)用于中成藥處方，是一味臨床利用率較高的活血補(bǔ)血中藥[2-5]。自《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）1977年版首次收載雞血藤，歷版均沿用收載，且基原相同[2]。雞血藤現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括【性狀】【鑒別】【檢查】等[1]，尚缺少化學(xué)成分信息相關(guān)的質(zhì)量控制項(xiàng)，存在進(jìn)一步提高與完善的空間。本研究在對15批雞血藤飲片進(jìn)行現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制項(xiàng)目檢測的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了薄層鑒別方法，同時(shí)建立了能夠充分體現(xiàn)本品化學(xué)成分信息的HPLC指紋圖譜，及其主要成分兒茶素和表兒茶素的含量測定方法，為全面、有效地控制本品質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。
1 儀器與試藥
Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng)（包括Waters 2690液相色譜儀、PDA紫外檢測器，美國Waters公司）。METTLER XS105型電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗儀（中國昆山市超聲儀器有限公司）。
兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸、沒食子酸、原兒茶醛、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、芒柄花素對照品（批號(hào)分別為110877- 201604、110878-201703、111809-201205、110831-201605、110810-201608、111738- 201603、111709-201702、111502-200402、111704-201703、111703-201504，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲酸（色譜純，F(xiàn)ischer公司），甲醇、乙酸乙酯（分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司）。
15批雞血藤樣品（批號(hào)分別為20160901、20160902、20161001、20161002、20161003、1611001、1612001、1612002、1612003、1701001、1701002、1701003、1702001、1702002、1702003，編號(hào)分別為1~15）以及市場收集雞血藤樣品2份（編號(hào)為16~17）、雞血藤偽品3批（分別為大血藤、雷公藤、過崗龍，編號(hào)為18~20）均由株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供，并經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張南平主任藥師、康帥副研究員鑒定，雞血藤來源于豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn，大血藤來源于木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata（Oliv.）Rehd. Et Wils.，雷公藤來源于衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii J.D. Hooker，過崗龍來源于豆科植物榼藤Entada phaseoloides（Linnaeus）Merrill。
2 標(biāo)準(zhǔn)檢測
取雞血藤樣品粉末適量，分別按照《中國藥典》2015年版一部雞血藤項(xiàng)下規(guī)定的水分、總灰分和浸出物測定方法對15批雞血藤飲片進(jìn)行檢測，結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，測定結(jié)果見表 1。
表 1 測定結(jié)果
3 方法與結(jié)果
3.1 薄層色譜鑒別
3.1.1 對照品溶液制備
取芒柄花素對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成每1 mL中約含0.1 mg的對照溶液。
取對照藥材粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯10 mL萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙庥? mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。
3.1.2 供試品溶液制備
取雞血藤樣品適量，粉碎，取粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯10 mL萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙庥? mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。
3.1.3 展開與檢視
照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、對照藥材、對照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（20:1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
3.1.4 樣品檢測
按“3.1.3”節(jié)下展開與檢視條件對15批飲片及市場收集正偽品進(jìn)行薄層色譜鑒別，代表性TLC圖見圖 1。在此條件下斑點(diǎn)分離較好，顯色清晰，且15批飲片的薄層鑒別結(jié)果一致性較好，能區(qū)分正偽品。
D.對照藥材；M.芒柄花素；1 ~ 4及16 ~ 17.樣品；18 ~ 20.偽品。
圖 1 雞血藤飲片及偽品薄層色譜圖
3.2 指紋圖譜
3.2.1 對照品溶液制備
取原兒茶酸對照品適量，用甲醇溶解，制成每1 mL中約含0.1 mg的混合對照溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。
3.2.2 供試品溶液制備
同薄層色譜鑒別“3.1.2”節(jié)方法。
3.2.3 色譜條件
色譜柱：Agilent Zobarx SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.1%甲酸（B）梯度洗脫（0~5 min，3%A~8%A；5~20 min，8%A~10%A；20~45 min，10%A~20%A；45~100 min，20%A~43%A；100~105 min，43%A~85%A）；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1 mL· min-1。
3.2.4 方法學(xué)考察
3.2.4.1 精密度
取同一供試品溶液（批號(hào)1702002），按“3.2.3”節(jié)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以原兒茶酸為參照峰，計(jì)算色譜圖中特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別為0.1%~0.4%、0.2%~1.3%，表明儀器精密度良好。
3.2.4.2 重復(fù)性
取同一批次雞血藤樣品（批號(hào)1702002），按“3.2.2”節(jié)下方法制備6份供試品溶液，按“3.2.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以原兒茶酸為參照峰，計(jì)算色譜圖中特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別為0.1%~0.5%、0.7%~5.3%，表明方法重復(fù)性良好。
3.2.4.3 穩(wěn)定性
取同一供試品溶液（批號(hào)1702002），分別于0、6、12、18、24 h，按“3.2.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以原兒茶酸為參照峰，計(jì)算色譜圖中特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別為0.1%~0.4%、0.3%~3.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
3.2.5 指紋圖譜的建立與分析
取15批雞血藤飲片樣品，按“3.2.2”節(jié)下方法制備供試品溶液，按“3.2.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)開發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)研究版》（2012年版），對15批雞血藤樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立了指紋圖譜（見圖 2），相似度計(jì)算結(jié)果見表 2。結(jié)果顯示，所有樣品指紋圖譜相似度均高于0.8，其中13批樣品相似度高于0.9。
R.對照指紋圖譜；1~15.樣品。
圖 2 雞血藤飲片HPLC指紋圖譜
表 2 相似度計(jì)算結(jié)果
研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，上述指紋圖譜可有效區(qū)分市場收集的雞血藤正品與偽品，如圖 3所示。其中雞血藤樣品16、17相似度計(jì)算結(jié)果分別為0.807、0.945，而偽品大血藤（18）、雷公藤（19）和過崗龍（20）的相似度計(jì)算結(jié)果分別為0.377、0.272、0.051，且其圖譜與雞血藤對照指紋圖譜明顯不同。另外，將所有樣品譜圖導(dǎo)入ChemPattern軟件進(jìn)行主成分分析，PCA得分圖（見圖 4）可區(qū)分雞血藤樣品與偽品。
R.對照指紋圖譜；16~17.雞血藤正品；18~20.雞血藤偽品。
圖 3 雞血藤正偽品HPLC譜圖
圖 4 雞血藤正偽品主成分分析得分圖
此外，通過與對照品比較，經(jīng)保留時(shí)間與紫外吸收光譜比對，指認(rèn)樣品中10個(gè)共有色譜峰（見圖 5），編號(hào)1~10分別標(biāo)記為沒食子酸（6.3 min）、原兒茶酸（9.9 min）、原兒茶醛（14.2 min）、兒茶素（16.8 min）、表兒茶素（26.2 min）、大豆苷（33.2 min）、染料木苷（42.9 min）、大豆苷元（57.5 min）、染料木素（70.3 min）、芒柄花素（81.4 min）。
1.沒食子酸；2.原兒茶酸；3.原兒茶醛；4.兒茶素；5.表兒茶素；6.大豆苷；7.染料木苷；8.大豆苷元；9.染料木素；10.芒柄花素。
圖 5 雞血藤飲片HPLC指紋譜圖
3.3 含量測定
3.3.1 對照品溶液制備
取兒茶素、表兒茶素對照品適量，用甲醇溶解，分別制成每1 mL中約含0.1 mg、1 mg的對照溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，作為混合對照品儲(chǔ)備溶液。
3.3.2 供試品溶液制備
取雞血藤樣品適量，粉碎，取粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。
3.3.3 色譜條件
色譜柱：Agilent Zobarx SB C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.1%甲酸（B）梯度洗脫（0~5 min，3%A~8%A；5~20 min，8%A~10%A；20~45 min，10%A~20%A；45~55 min，20%A~85%A；55~60 min，85%A）；檢測波長：202 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1 mL· min-1。色譜圖如圖 6所示：
A．對照品；B. 樣品（1. 兒茶素；2. 表兒茶素）。
圖 6 雞血藤飲片 HPLC 含量測定譜圖
3.3.4 方法學(xué)考察
3.3.4.1 線性范圍
取“3.3.1”節(jié)下混合對照品溶液分別用甲醇稀釋成系列濃度，按“3.3.3”節(jié)下色譜條件分別進(jìn)樣，以質(zhì)量為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。結(jié)果兒茶素、表兒茶素分別在0.00999~0.499 μg、0.0503~2.014 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表 3。
表 3 兒茶素、表兒茶素的線性、檢出限、定量限
3.3.4.2 檢出限和定量限
將對照品溶液稀釋至不同濃度，進(jìn)樣測定，以信噪比3:1為檢出限、10:1為定量限，測定結(jié)果見表 3。
3.3.4.3 精密度
取同一供試品溶液（批號(hào)1 7 0 2 0 0 2），按“3.3.3”節(jié)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。兒茶素與表兒茶素的峰面積RSD分別為2.9%、0.6%，表明方法精密度良好。
3.3.4.4 重復(fù)性
分別取同一批雞血藤樣品（批號(hào)1702002）6份，精密稱定，按“3.3.2”節(jié)下方法制備供試品溶液，按“3.3.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣測定。以干燥品計(jì)，結(jié)果測得兒茶素的含量分別為0.044%、0.041%、0.045%、0.045%、0.045%、0.045%，RSD為3.6%；表兒茶素的含量分別為0.17%、0.16%、0.17%、0.17%、0.17%、0.17%，RSD為1.6%。表明方法重復(fù)性良好。
3.3.4.5 穩(wěn)定性
取同一供試品溶液（批號(hào)1702002），分別于0、6、12、18、24 h，按“3.3.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。兒茶素與表兒茶素的峰面積RSD分別為3.2%、0.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
3.3.4.6 加樣回收率
精密稱取已測知兒茶素、表兒茶素含量的雞血藤樣品0.5 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入兒茶素、表兒茶素質(zhì)量濃度分別為0.0858、0.3588 mg·mL-1的對照品溶液2 mL，精密加入甲醇18 mL，密塞，稱量，超聲（功率300 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的量，濾過，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試溶液。進(jìn)樣測定，結(jié)果兒茶素與表兒茶素的平均回收率分別為107.0%、105.8%，RSD分別為3.4%、2.9%。
3.3.5 樣品測定
15批樣品按“3.3.2”節(jié)制備供試品溶液，按“ 3. 3. 3 ”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣測定。以干燥品計(jì)，樣品中兒茶素與表兒茶素含量分別為0.039%~0.068%、0.12%~0.23%，詳見表 4。
表 4 含量測定結(jié)果
4 討論
4.1 樣品前處理
由于雞血藤含有較多鞣質(zhì)成分，易對其他化學(xué)成分分析造成干擾[6-9]。因此，試驗(yàn)過程中考察藥材粉末甲醇、乙醇、60%甲醇直接超聲提取以及提取后乙酸乙酯、正丁醇分別萃取等前處理方式，結(jié)果表明，采用甲醇超聲提取后乙酸乙酯萃取可較大程度地減少樣品中所含鞣質(zhì)類成分引起的干擾。
4.2 色譜條件
考察了Agilent Zobarx SB C18、Agilent TC C18、Phenomix Gemini C18、Waters Symmetry shield C18等不同型號(hào)色譜柱，以及乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水等不同流動(dòng)相體系。結(jié)果顯示，采用Agilent Zobarx SB C18柱、乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫能夠較好分離樣品中色譜峰。指紋圖譜分析考察發(fā)現(xiàn)UV 260 nm波長下樣品中色譜峰信息豐富，背景噪音低。含量測定考察發(fā)現(xiàn)UV 202 nm波長下，檢測成分色譜峰分離較好，盡管甲酸在末端波長有吸收，但并未干擾指標(biāo)成分分析，且方法學(xué)考察符合含量測定有關(guān)要求。
4.3 薄層色譜鑒別
試驗(yàn)首先參照《中國藥典》2015年版一部雞血藤薄層鑒別項(xiàng)下展開系統(tǒng)與檢視條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件下正偽品呈現(xiàn)斑點(diǎn)較為相似，難以有效區(qū)分，因而進(jìn)一步通過條件摸索發(fā)現(xiàn)三氯甲烷-甲醇（20:1）展開，紫外光燈（365 nm）檢視樣品斑點(diǎn)清晰，而偽品則無相應(yīng)斑點(diǎn)出現(xiàn)。
4.4 指紋圖譜
雞血藤飲片中所含化學(xué)成分極性差異較大，本研究所建立指紋圖譜能夠較為全面地反映不同極性的化學(xué)成分信息。從相似度計(jì)算結(jié)果來看，雞血藤飲片相似度均高于0.8，分析顯示不同批次樣品所含主要色譜峰基本一致，主要差別在于部分色譜峰峰面積存在一定差異。此外，所建立指紋圖譜能夠明顯區(qū)分大血藤、雷公藤和過崗龍等雞血藤偽品。
4.5 含量測定
試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，雞血藤中含量較高的成分主要集中于極性相對較大的水溶性成分，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[10-16]，研究建立了本品兒茶素和表兒茶素的含量測定方法。從測定結(jié)果來看，兒茶素含量整體較低，表兒茶素含量較高，可選擇表兒茶素作為本品含量測定指標(biāo)成分。
綜上所述，本研究針對雞血藤所含化學(xué)成分特點(diǎn)，優(yōu)化并研究建立了薄層色譜鑒別、指紋圖譜及含量測定的多維質(zhì)量控制方法，為更全面、有效地控制與評價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量，以及本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高與完善提供了科學(xué)依據(jù)。
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