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嘉峪檢測網(wǎng) 2019-05-28 16:37
前一段時(shí)間，小編有幸參加了仿制藥峰會(huì)，其中在一個(gè)小組討論會(huì)上，很多實(shí)驗(yàn)猿們問到同一個(gè)問題：
“溶出方法驗(yàn)證中，除了標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)以外，其他幾個(gè)介質(zhì)也需要同樣的方法驗(yàn)證嗎？”
對此，大家都表示這點(diǎn)上，中美意見不一。
在美國，只需要做標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)中的方法學(xué)驗(yàn)證。
但是在國內(nèi)，每個(gè)溶出曲線所用介質(zhì)中的方法學(xué)驗(yàn)證都需要做。
巨大的工作量呀，一堆分析青年已哭暈在地！
身為無能為力，只能完成的一份子。小編只能說，該做還得做。
這時(shí)候我們提高工作效率的方法就只剩一條路，就是思路清晰，安排合理，減少出錯(cuò)。
今天小編就分享一下，對于溶出方法學(xué)的驗(yàn)證，有哪些工作需要做呢？
溶出度方法驗(yàn)證基本包括如下幾項(xiàng)
（1）專屬性
（2）準(zhǔn)確度
（3）精密度
（4）線性和范圍
（5）耐用性
相信下面這個(gè)表格，大家再熟悉不過了吧，身為分析工作人員，見它的次數(shù)甚至多余自己的同學(xué)和好友。
接下來我們就詳細(xì)討論一下我們的溶出方法學(xué)到底該怎么做。
1.溶解度在微溶以下的藥物；
2.溶解度雖在略溶以上，但處方與工藝造成阻溶的制劑；
3.治療劑量與中毒劑量接近的制劑；
4.緩釋制劑、控釋制劑、腸溶制劑等；
5.易溶于水或極易溶于水的藥物，也要考察溶出度。
這條不多說，不在范圍內(nèi)的大家估計(jì)也不會(huì)做~~~~
溶出介質(zhì)除了參考各國藥典外，還要根據(jù)自制樣品的處方工藝，選擇具有區(qū)分力的介質(zhì)。
溶出曲線一般要考察至少3種介質(zhì)，對于仿制藥，在標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)中的溶出曲線必做。
溶出介質(zhì)第一次配制時(shí)，要測定pH值，與標(biāo)準(zhǔn)值的差值應(yīng)不超過0.1（對于pH依賴性藥物，差值應(yīng)不超過0.05）。溶出介質(zhì)使用前要加熱、超聲或真空脫氣。
常用溶出介質(zhì)：
pH1.0~2.2，溶出介質(zhì)：鹽酸溶液
pH3.8~4.0，溶出介質(zhì)：醋酸鹽酸緩沖液
pH4.5~5.8，溶出介質(zhì)：醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液
pH6.8~8.0，溶出介質(zhì)：磷酸鹽緩沖液
溶出介質(zhì)體積的選擇
漏槽條件
溶出介質(zhì)的量至少是藥物全部溶解時(shí)用量的3倍以上，即滿足漏槽條件。
漏槽條件指藥物溶解度的3~7倍體積，是做溶出的最佳條件，一般情況下我們選擇溶出介質(zhì)的體積為500ml、900ml和1000ml。
在制劑的溶出曲線測定過程中溶劑的體積超過此漏槽條件，可視樣品在溶劑中的溶出過程不受溶劑體積的影響。
如何測定待測樣品溶解度？
測定步驟：
（1）將待測樣品所用原料置于各介質(zhì)中（如標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)、0.1mol/L鹽酸介質(zhì)、pH4.5醋酸緩沖液，pH6.8磷酸鹽緩沖液、水等），配制成飽和溶液。
（2）將飽和溶液放置在振蕩器中，設(shè)定溫度為37±0.5℃、轉(zhuǎn)速200rpm，振蕩滿24小時(shí)。
（3）將溶液取出，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測定溶液中原料的含量，計(jì)算溶解度。
如果選擇900ml介質(zhì)不能滿足漏槽條件的情況下考慮添加一定量的表面活性劑，如SDS，吐溫；從最小添加比例開始篩選，0.05%，0.1%······0.5%。
如果仍不能滿足溶出要求，考慮原料處理，如微粉化行不行，輔料選擇優(yōu)化；或者做成包合物，固體分散體新劑型。
該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)需在樣品小試過程中需要完成的，對處方的優(yōu)化也有一定指導(dǎo)作用。
中國藥典中測定方法包括第一法（轉(zhuǎn)籃法）、第二法（漿法）、第三法（小杯法）。其中小杯法的適用范圍小。
轉(zhuǎn)籃法——75rpm/100rpm，以100rpm為主。適用范圍有膠囊劑、丸劑、片劑、或是一些漂浮的制劑。
槳法——50rpm/75rpm，以50rpm為主。適用范圍有片劑、膠囊劑和丸劑。
一般認(rèn)為槳法50rpm相當(dāng)于轉(zhuǎn)籃法100rpm
如：參照中國藥典2015版二部厄貝沙坦分散片溶出度項(xiàng)下條件采用的溶出方法及轉(zhuǎn)速：槳法（中國藥典2015版四部-通則0931第二法）、轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn)。
2015版藥典四部-通則0931第二法
將對照液在200nm~400nm進(jìn)行紫外掃描，一般選擇最大吸收波長，但需排除輔料或溶出介質(zhì)的干擾。
如：采用紫外-可見分光光度法測定，取厄貝沙坦對照品20mg，置100ml量瓶中，加溶出介質(zhì)0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml置100ml量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，以0.1mol/L鹽酸溶液為空白在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描。
另取輔料、自制制劑、參比制劑同法用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含厄貝沙坦10μg的溶液，在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描。
首先要明確，在溶出方法學(xué)驗(yàn)證中，所用的溶媒是溶出介質(zhì)。
專屬性目的是考察輔料和膠囊殼對溶出度測定是否有干擾。
HPLC法判斷標(biāo)準(zhǔn)：
滿足以下條件說明該方法的專屬性符合要求。
（1）空白溶液、空白輔料，對主要成分無干擾，在主成分的位置不出峰；
（2）供試品溶液色譜峰的理論板數(shù)、拖尾因子要符合要求；
（3）對照品溶液和供試品溶液的峰面積相差不超過10%。也就是說對照品溶液和供試液的濃度不要相差太大，因?yàn)椴煌南♂尡稊?shù)，稀釋過程中所用的試劑、玻璃容器、溶出介質(zhì)、都有可能造成專屬性的誤差。
UV法專屬性試驗(yàn)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)：
干擾溶液配置：
（1）空白溶劑
（2）空白輔料溶液
（3）膠囊劑應(yīng)配置空膠囊殼溶出液（嚴(yán)格按照樣品溶出度測定的步驟，取6粒空白膠囊殼進(jìn)行試驗(yàn)。盡可能完全的除盡膠囊內(nèi)容物）。
取這3種溶液適量，做紫外檢測，記錄吸光度，根據(jù)對照品溶液結(jié)果，測定干擾值。
干擾試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：
干擾值在2%以下可忽略不計(jì)，2~5%之間可適當(dāng)將限度提高（如厄貝沙坦膠囊溶出度限度為標(biāo)示量的80%，但是干擾試驗(yàn)為4%，可將限度相應(yīng)提高為85%），超過5%則測定方法不可用。
如果是膠囊產(chǎn)生的干擾試驗(yàn)，應(yīng)進(jìn)行囊殼的消除試驗(yàn)。首先空膠囊僅對UV測定有干擾，藥典規(guī)定如干擾不大于標(biāo)示量的2% ，可忽略不計(jì)；干擾大于標(biāo)示量的2%，可更換波長或者再換一種其他膠囊殼，減少測定干擾。
膠囊殼的批次、來源不用、紫外吸收強(qiáng)度也各不相同，故干擾也常常不同。若膠囊殼的干擾較大時(shí)，建議采用HPLC法進(jìn)行測定。
取對照品適量，按標(biāo)準(zhǔn)方法配制一系列濃度的溶液，通常不少于6份，例如20%、40%、60%、80%、100%（標(biāo)準(zhǔn)濃度）、120%。
線性的最低點(diǎn)最好包含溶出曲線第一點(diǎn)的溶出值。
如：厄貝沙坦在以0.1mol/L鹽酸溶液900ml為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn)，依法操作，分別于5min、10min、15min、20min、30min、45min時(shí)，取溶出液測定吸光度，計(jì)算得5min時(shí)溶出度為13.6%，則標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍可以設(shè)定為10%、25%、50%、75%、100%（標(biāo)準(zhǔn)濃度）、150%。
設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)濃度時(shí)請注意以下兩點(diǎn)。
（1）HPLC法：最低濃度樣品的色譜圖中，信噪比不低于10:1。
（2）UV法：最佳吸光度在0.3~0.7之間，根據(jù)具體樣品也可以0.2~0.8之間。
以峰面積（吸光度值）對濃度進(jìn)行線性回歸，線性相關(guān)系數(shù)r不小于0.9990。
y軸截距的絕對值不超過100%濃度樣品峰面積的2%。
儀器精密度
取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針/連續(xù)測定6次紫外吸光度值。
規(guī)定：HPLC峰面積/紫外吸光度值的RSD不超過2.0%，保留時(shí)間RSD不超過1.0%。
重復(fù)性
取待測樣品1片/粒，置溶出杯中，按照溶出度方法進(jìn)行測定，至取樣點(diǎn)時(shí)取溶出液，分為6份，分別進(jìn)行溶出度測定，計(jì)算RSD。
規(guī)定：HPLC峰面積/吸光度的RSD不超過2.0%（n=6）。
小編提示：該項(xiàng)試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)（批間均一性）并不相同。
重復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明以本方法制備供試品溶液測定時(shí)重復(fù)性良好。
重現(xiàn)性試驗(yàn)時(shí)考察制劑工藝穩(wěn)定性及溶出度方法重復(fù)性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
中間精密度
與重復(fù)性同時(shí)取樣，由不同的實(shí)驗(yàn)人員，用不同檢測儀器。
規(guī)定：測定結(jié)果與重復(fù)性的結(jié)果合并計(jì)算，HPLC峰面積/吸光度RSD不超過2.0%（n=12）。
包括對照品溶液穩(wěn)定性和供試液穩(wěn)定性。
對照品溶液穩(wěn)定性：取對照品溶液適量，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天測定吸光度值/峰面積值，計(jì)算穩(wěn)定性。
供試液穩(wěn)定性：取自制樣品適量，用相應(yīng)介質(zhì)制備成供試液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12、24小時(shí)······測定吸光度或峰面積值，計(jì)算穩(wěn)定性。
規(guī)定：取每時(shí)間點(diǎn)的主峰峰面積/吸光度值，計(jì)算其RSD，應(yīng)不大于2%，則說明該溶液在此時(shí)間段內(nèi)的穩(wěn)定性良好。
穩(wěn)定性時(shí)間的考察以滿足自己的實(shí)驗(yàn)需求為準(zhǔn)。
例如考慮到成本問題，對于穩(wěn)定性很好的對照品，可以配置成貯備液使用，但是需要考察日間穩(wěn)定性。
對于UV法測定的供試液，一般穩(wěn)定性做到24小時(shí)即可，緩控釋制劑可相對延長時(shí)間。
對于HPLC法測定的供試液，一般需滿足一條溶出曲線所有樣品測定完全的時(shí)間。
如：取對照品溶液，室溫放置5天，分別于第0小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2015年版四部通則0401）在245nm波長處測定吸光度。
如：某緩釋片溶出度利用HPLC法測定，每針運(yùn)行時(shí)間為5分鐘，取樣點(diǎn)為11個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)為12個(gè)樣品，那么完成一條溶出曲線的測定至少需要5×11×12=660分鐘，那么穩(wěn)定性試驗(yàn)至少需要測定11小時(shí)的穩(wěn)定性。
對于溶出度，范圍規(guī)定為限度的±20％（回收率高、中、低常設(shè)為50％、限度濃度、100％）。
如果限度為80%，那三個(gè)點(diǎn)是50%、80%、100%還是60%、80%、100%？根據(jù)實(shí)驗(yàn)的便利性來就好了。
對于緩控釋制劑，該限度照樣適用。如鹽酸氨溴索緩釋膠囊溶出度限度為第1小時(shí)：15%~45%，則回收率最低點(diǎn)應(yīng)為15%的±20％。
取對照品適量，依法配制成相當(dāng)于標(biāo)示量50%、限度和100%的供試品溶液，均加入處方量的輔料（包括膠囊殼），必要時(shí)超聲使主成分溶解，每個(gè)濃度平行配制3份，依法測定含量。
規(guī)定：3個(gè)濃度的平均回收率均為98.0%~102.0%；RSD≤2.0%（n=9）。
該方法只能說明方法測定的準(zhǔn)確度良好，不能說明將樣品加入溶出儀中，溶出后的溶液的測定準(zhǔn)確度是良好的。所以就有了方法2.
稱取對照品（按標(biāo)示量）6份，分別投入6個(gè)溶出杯中，每個(gè)溶出杯中均已加入不含主藥的輔料（1粒/片量），按溶出度測定方法測定，計(jì)算溶出回收率。
規(guī)定：6個(gè)樣品的平均回收率均為98.0%~102.0%；RSD≤2.0%（n=6）。
很多分析實(shí)驗(yàn)猿們會(huì)問：
如果制定的溶出方法與含量測定方法均為HPLC法，且色譜條件一致，共用一套耐用性數(shù)據(jù)可以嗎？
答案很明確，不可以！
因?yàn)榧词股V條件一致，也會(huì)存在樣品濃度和溶媒的不同，因此仍舊需要考察耐用性。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)同含量測定，需要考察柱溫、流速、波長、色譜柱、流動(dòng)相中有機(jī)相與水相比例及水相濃度和pH值。對于使用UV法測定的溶出度，照樣需要考察耐用性，如波長、溶出介質(zhì)濃度等。
最重要一點(diǎn)：不管為了與QC完美對接，還是和廠家妥善交接，都需要驗(yàn)證不同品牌溶出儀之間的耐用性。
最后，落到咱們最初討論過的那個(gè)問題，不同介質(zhì)的方法學(xué)驗(yàn)證要驗(yàn)證哪些內(nèi)容？
很不幸的說，專屬性、線性和范圍、精密度、穩(wěn)定性、回收率、耐用性全部都要驗(yàn)證。。。。。。
例如：參照中國藥典2015版二部厄貝沙坦膠囊溶出度項(xiàng)下條件采用的溶出介質(zhì)為：0.1mol/L鹽酸溶液，但是溶出曲線比對分別考察了水、pH4.5醋酸鹽緩沖液和pH6.8磷酸鹽緩沖液，那么溶出方法學(xué)驗(yàn)證需要分別考察在這4種介質(zhì)（0.1mol/L鹽酸溶液、水、pH4.5醋酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液）中的專屬性、線性和范圍、精密度、穩(wěn)定性、回收率、耐用性。
希望大家將溶出方法學(xué)驗(yàn)證方法爛熟于心，合理安排，減少出錯(cuò)。
來源：藥研江湖
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