摘要：
目的：通過比較蛋黃來源及大豆來源溶血磷脂酰膽堿對紅細胞影響的差異來評價目前藥用輔料中不同來源溶血磷脂酰膽堿含量限值的合理性。
方法：采用體外紅細胞溶血試驗及紅細胞滲透脆性試驗考察兩種不同來源溶血磷脂酰膽堿對紅細胞的影響。
結(jié)果：蛋黃來源及大豆來源溶血磷脂酰膽堿紅細胞溶血IC50分別為0.0427mg·mL-1、0.0801mg·mL-1；二者在0.65%、0.60%、0.55% NaCl低滲鹽溶液中引起的溶血率亦具有顯著性差異，蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿的溶血率明顯高于大豆來源溶血磷脂酰膽堿。但紅細胞凝聚試驗結(jié)果表明，二者均未見引起紅細胞凝聚。
結(jié)論：兩種不同來源的溶血磷脂酰膽堿致溶血能力具有顯著性差異，建議應(yīng)分別制定不同來源磷脂類產(chǎn)品中溶血磷脂酰膽堿的含量限值，以保證臨床用藥安全。
磷脂是一種難溶于丙酮的含磷類脂物，廣泛存在于自然界的動植物體內(nèi)，主要分為甘油磷脂和鞘磷脂兩大類。其中甘油磷脂以甘油為母體結(jié)構(gòu)，一般常見的磷脂類化合物如磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等皆屬于甘油磷脂，而鞘磷脂則以神經(jīng)鞘氨醇為母體。在眾多種類的磷脂類化合物中，最為常用的是卵磷脂。卵磷脂按照來源不同可分為蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂，其組成亦隨來源和純化程度的不同而不同?！吨袊幍洹?2015年版四部規(guī)定：蛋黃卵磷脂含磷脂酰膽堿不得少于68%，含磷脂酰乙醇胺不得過20%；大豆卵磷脂含磷脂酰膽堿不得少于45%，含磷脂酰乙醇胺不得過30%[1-2]。卵磷脂具有乳化、分散、助滲等特性，并對皮膚和粘膜具有很強的親和力。因此，常作為乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑等廣泛應(yīng)用于包括注射液在內(nèi)的液體制劑、半固體制劑、固體制劑和前體藥物制劑的制造[3]。
由于卵磷脂是最為常用的磷脂類化合物，因而溶血磷脂一般是指溶血卵磷脂，又稱溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC），是卵磷脂在磷脂酶A作用下，1位或2位酯鍵水解或酶解產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，在原料制備、純化及儲藏等過程中，部分卵磷脂會分解產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿[4]。LPC具有較強表面活性，因此能使紅細胞及其他細胞膜破裂，引起溶血或細胞壞死[5]。LPC導(dǎo)致溶血后，使毛細血管通透性增加而引起出血，使組織釋放組織胺、5-羥色胺、腎上腺素、緩動素等，間接影響心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的功能，激發(fā)一系列復(fù)雜的病理反應(yīng)。因此，LPC含量是藥品，尤其是注射劑重要的質(zhì)量控制指標，直接關(guān)聯(lián)藥品的臨床用藥安全，需對其含量進行嚴格控制[6]。本試驗根據(jù)溶血磷脂酰膽堿的致溶血特性，比較蛋黃來源及大豆來源LPC對紅細胞產(chǎn)生的影響，通過評價二者的致溶血能力，以評估目前藥用輔料中不同來源溶血磷脂酰膽堿含量限值的合理性。
1 儀器與試藥
酶標儀，美國BioTeK，型號：synergyHT；CO2培養(yǎng)箱，美國THERMO，型號：3141；高速冷凍離心機，美國Beckman，型號：J-25；電子分析天平，瑞士METTLER，型號：AE240。
大豆來源溶血磷脂酰膽堿購自Sigma，批號：SLBH5115V；蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿購自Sigma，批號：SLBH3673V；Triton ×100購自Sigma，批號：SLBS6421；氯化鈉注射液購自石家莊四藥有限公司。
2 方法與結(jié)果
2.1 紅細胞溶血試驗
家兔心臟采血20 mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。氯化鈉注射液洗滌，約1200 g，離心10 min，收集紅細胞，使用氯化鈉注射液稀釋成0.5%紅細胞懸液。大豆來源溶血磷脂酰膽堿及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿采用倍比稀釋，具體試驗用濃度詳見表 1。96孔板中每孔加入200 μL0.5%紅細胞懸液，20 μL各濃度受試樣品，另設(shè)陽性對照：1% Triton ×100，陰性對照：0.9%氯化鈉注射液。37℃孵育2 h，約1200 g，離心10 min，取100 μL上清，405 nm下測定吸光度，計算溶血率[7-8]。
表 1 大豆來源及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿溶血試驗劑量表
紅細胞溶血試驗結(jié)果顯示大豆及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿的紅細胞溶血IC50分別為0.0801 g·L-1、0.0427 g·L-1。大豆來源溶血磷脂酰膽堿溶血IC50高于蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿，經(jīng)配對t檢驗統(tǒng)計分析具有顯著性差異（p＜0.05，n= 4）。紅細胞溶血率詳見圖 1。
圖 1 大豆來源及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿溶血率（n=4，x±sd）
2.2 紅細胞滲透脆性試驗
新鮮家兔全血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，使用0.9%氯化鈉注射液1：10稀釋。將0.1g·L-1大豆來源溶血磷脂酰膽堿及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿加入稀釋兔全血中，37 ℃孵育1 h。孵育結(jié)束后，輕輕顛倒2~3次，加入不同濃度低滲鹽溶液。低滲鹽溶液濃度：0.9%、0.65%、0.6%、0.55%、0.5%、0.45%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%的NaCl溶液。混勻后室溫靜置1 h，肉眼觀察試管溶液的顏色及澄明度。約1200 g，離心5 min，取上清，405 nm處測定吸光度。使用5%葡萄糖作為陰性對照[9-10]。此部分實驗結(jié)果使用Graphpad統(tǒng)計軟件處理，采用t-test及ANOVA方差分析進行顯著性差異檢驗。
紅細胞滲透脆性實驗結(jié)果顯示：0.1mg·mL-1的大豆及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿在0.65%、0.60%、0.55%低滲NaCl鹽溶液中，引起的溶血率均具有顯著性差異，蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿的溶血率明顯高于大豆來源溶血磷脂酰膽堿。二者發(fā)生完全溶血所對應(yīng)的NaCl溶液濃度分別0.50%、0.55%，均明顯高于陰性對照發(fā)生完全溶血的NaCl溶液濃度0.40%。
表 2 大豆來源及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿紅細胞滲透脆性試驗結(jié)果（n=4，x±sd）
2.3 紅細胞凝聚試驗
家兔心臟穿刺取血大約20 mL，放入加有玻璃珠的無菌三角瓶中，通過玻璃珠攪動制成脫纖血。加入約10倍量0.9%氯化鈉溶液，混勻，約1200 g，離心15 min。除去上清液，沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌3次，直至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的紅細混懸液，備用。參考《中國藥典》2015年版四部通則方法，將0.1 g·L-1大豆來源及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿分別加入紅細胞懸液，37 ℃孵育3 h后，觀察紅細胞聚集程度[2]。
結(jié)果表明，0.1 mg·mL-1大豆來源溶血磷脂酰膽堿及蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿加入紅細胞懸液，37 ℃孵育后，輕輕顛倒2~3次后，紅細胞聚集物皆可均勻分散，未見其凝聚沉淀。
3 討論
溶血磷脂酰膽堿由于其自身具有的較強表面活性等特性，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其中包括破裂紅細胞膜引起溶血，改變細胞滲透性等[11-12]。因而，應(yīng)嚴格控制藥品制劑中溶血磷脂酰膽堿的量，以保證臨床用藥的安全性。目前，《中國藥典》2015年版四部收載的大豆磷脂（供注射用）和蛋黃卵磷脂（供注射用）各論中，二者溶血磷脂酰膽堿的含量均為不得過3.5%[2]。而本研究通過紅細胞溶血及紅細胞滲透脆性試驗證明蛋黃來源溶血磷脂酰膽堿對紅細胞的影響作用明顯高于大豆來源溶血磷脂酰膽堿。由此可見，這種不區(qū)分溶血磷脂酰膽堿具體來源而對其含量進行統(tǒng)一規(guī)定做法的科學(xué)性有待商榷。因而，建議不同來源磷脂類產(chǎn)品的質(zhì)量標準應(yīng)根據(jù)其所含溶血磷脂酰膽堿自身特性分別制定其含量限值，以保證相關(guān)注射劑產(chǎn)品的臨床用藥安全。
參考文獻
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