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實驗方法原理

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同。 

在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。

實驗材料

細(xì)胞懸液

試劑、試劑盒

臺盼蘭四甲基偶氮唑鹽酸化異丙醇

儀器、耗材

臺盼蘭四甲基偶氮唑鹽酸化異丙醇

實驗步驟

一、細(xì)胞計數(shù) 

1.  將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。 

2.  將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。 

3.  靜置3分鐘。 

4.  鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算： 

細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10 000 

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

二、細(xì)胞活力 

1.  將細(xì)胞懸液以0.5 ml加入試管中。 

2.  加入0.5 ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2-3分鐘。 

3.  吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。 

4.  鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力。 

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。 

活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

三、MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力 

活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。 

1.  細(xì)胞懸液以1 000 rpm離心10分鐘，棄上清液。 

2.  沉淀加入0.5-1 ml MTT，吹打成懸液。 

3.  37℃下保溫2小時。 

4.  加入4-5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。 

5.  1 000 rpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計570 nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點。 

注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。

附：1、0.4%臺盼蘭染液配制： 

臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml.

2、MTT配制： 

MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。

3、酸化異丙醇配制： 

異丙醇中加入HCl使最終達(dá)0.04mol/L。