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在硅膠上或雜化基質(zhì)顆粒上鍵合了如C18、C8、C4或苯基等鍵合相的色譜填料所裝填的色譜柱，按反相色譜條件進(jìn)行操作和分離。反相是液相色譜中最常使用的分離模式，而C18柱是最常使用的反相色譜柱之一。

新色譜柱的活化與柱效測(cè)試

拿到一根新的色譜柱，首先要做的事情是查看色譜柱的說明書，了解色譜柱的基本信息，包括pH值范圍、最高操作溫度、最大操作壓力等信息，再查看色譜柱柱效測(cè)試報(bào)告，準(zhǔn)備柱效測(cè)試所用分析物及試劑，然后按以下步驟進(jìn)行色譜柱活化及柱效測(cè)試：

1 液相連接二通，使用新鮮經(jīng)過濾的水和乙腈或甲醇（根據(jù)測(cè)試報(bào)告中的流動(dòng)相選擇有機(jī)溶劑）沖洗液相系統(tǒng)，確保液相系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。

2 將色譜柱入口端連接到液相系統(tǒng)上，柱出口端先不連接檢測(cè)器，應(yīng)直接連到廢液收集器；色譜柱上有箭頭標(biāo)明正確方向，取用色譜柱時(shí)避免磕碰掉落。

3 在0.1ml/min流速下用乙腈（甲醇）或保存溶劑潤(rùn)洗色譜柱，最少2小時(shí)，或按照色譜柱說明書上的方法進(jìn)行活化。

4 參照柱效測(cè)試報(bào)告中的方法，更換柱效測(cè)試所用流動(dòng)相，緩慢調(diào)節(jié)流速至柱效測(cè)定流速，平衡色譜柱，至少5-10倍柱體積流動(dòng)相（例如：250×4.6mm 的色譜柱柱體積為 4.2 ml，以 1 ml/min 流速10倍柱體積需要平衡 42 分鐘），直至壓力和基線穩(wěn)定。

常見色譜柱柱體積匯總表

5參照柱效測(cè)試報(bào)告中的方法測(cè)試柱效，如果測(cè)試結(jié)果略低于測(cè)試報(bào)告，屬于正常情況，如果結(jié)果明顯偏低、峰形拖尾，說明所使用的色譜柱或液相系統(tǒng)處于非理想狀態(tài)，需要進(jìn)行排查。

6 記錄測(cè)試方法及結(jié)果，并作為定期柱效測(cè)試的參考值。

色譜柱的使用

1了解色譜柱的使用限度，避免流動(dòng)相pH、柱溫、柱壓等超過色譜柱的使用上限，縮短色譜柱使用壽命或損壞。

2 流動(dòng)相必須過濾和脫氣，每過24h-48h就應(yīng)新配水相流動(dòng)相，并同時(shí)更換或清洗流動(dòng)相溶劑瓶，以避免流動(dòng)相長(zhǎng)菌。

3 再使用流動(dòng)相平衡色譜柱之前用5%-10%甲醇（乙腈）沖洗系統(tǒng)及色譜柱，確保系統(tǒng)及色譜柱中沒有緩沖鹽或較高的有機(jī)相，避免緩沖鹽遇較高濃度的有機(jī)相析出。

4 開始進(jìn)樣前，用20倍柱體積的起始流動(dòng)相條件進(jìn)行平衡；沒有充分老化平衡的色譜柱，將會(huì)出現(xiàn)柱效較低、以及保留時(shí)間漂移的問題。如果使用梯度條件，每次梯度之間，用8-10倍柱體積的起始流動(dòng)相條件再次平衡。

5 若使用雙通道在線混合流動(dòng)相，預(yù)先檢查流動(dòng)相各組分的兼容性，例如磷酸鹽緩沖液與高比例乙腈（≥70%）混用時(shí)，可能發(fā)生鹽析出。

6 確保樣品不含顆粒性雜質(zhì)，如果樣品過臟，或有微粒微粒存在，需要更換適合的樣品制備方法，再使用樣品過濾器時(shí)確保過濾膜與樣品溶劑不相溶，也可以考慮高速離心方法去除顆粒，例如8000轉(zhuǎn)數(shù)以上離心20分鐘，移取上清液進(jìn)樣。

7 確保樣品溶液與流動(dòng)相兼容，進(jìn)樣后不會(huì)發(fā)生沉淀，或溶劑不相溶情況。通常使用流動(dòng)相或比流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度弱的流動(dòng)相（即有機(jī)溶劑比例較低），溶劑或稀釋樣品，這樣可以獲得最好的峰形和檢測(cè)靈敏度。

8 每次啟動(dòng)泵時(shí)，應(yīng)將流速緩慢升高，避免直接從方法規(guī)定的流速啟動(dòng)泵（如從 0.1ml/min啟動(dòng)泵，每次升幅為0.1ml/min）。

9 分析過程中，每針或間隔數(shù)針使用空白溶液清洗柱內(nèi)可能累積的污染物，分析結(jié)束后采用高比例水相除去柱內(nèi)緩沖鹽，再采用高比例有機(jī)相除去柱內(nèi)的污染物。

10 檢測(cè)完成后，建議每8個(gè)小時(shí)后，將流動(dòng)相中乙腈的比例升高至 60％沖洗色譜柱45分鐘（此時(shí)不需要將含有離子對(duì)的緩沖鹽溶液換成水，保持柱溫 45℃或適合的較高溫度）；應(yīng)對(duì)色譜柱進(jìn)行徹底清洗，先用 10：90 乙腈（或甲醇）：水（體積比）沖洗色譜柱30分鐘（根據(jù)緩沖鹽或離子對(duì)的濃度調(diào)整沖洗時(shí)間），然后用高比例乙腈或甲醇沖洗 30-60分鐘。

11 色譜柱保存于高比例有機(jī)相中（乙腈或甲醇），如長(zhǎng)期不使用色譜柱需將色譜柱保存在說明中要求的保存液中，并定期對(duì)色譜柱進(jìn)行活化，以避免色譜柱中的保護(hù)液干涸。

12 在色譜柱使用過程中，定期進(jìn)行柱效測(cè)試，記錄塔板數(shù)及壓力，追蹤監(jiān)控色譜柱的性能變化；如發(fā)現(xiàn)色譜柱柱效下降，需進(jìn)行柱效測(cè)試進(jìn)行確認(rèn)，再生后再測(cè)試柱效以確定再生效果。

13 當(dāng)使用2.1mm色譜柱時(shí)，建議優(yōu)化系統(tǒng)，以減少譜帶展寬（譜帶擴(kuò)展體積不得超過20-40μl），包括使用檢測(cè)器微量流通池、減少進(jìn)樣器LOOP環(huán)體積、使用較小內(nèi)經(jīng)（如0.12mm）的系統(tǒng)管路,并確保色譜柱與管路連接恰當(dāng)，無死體積。

14 使用小顆粒填料（如2.5μm）短柱進(jìn)行快速分離時(shí)，需要考慮以下因素：

a. 確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)，無死體積，盡量?jī)?yōu)化系統(tǒng)減少譜帶展寬；

b. 提高采樣頻率至10點(diǎn)/秒以上；

c. 較小粒徑的色譜柱產(chǎn)生的柱壓較高，而較小粒徑要達(dá)到最優(yōu)色譜效率所需的線速度較高，請(qǐng)根據(jù)所用LC系統(tǒng)的實(shí)際情況調(diào)節(jié)流速；

d. 可使用較高的柱溫來補(bǔ)償小顆粒造成的壓力升高，例如40℃。

柱清洗與再生

保留時(shí)間漂移、壓力升高，色譜柱峰形發(fā)生變化如出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、肩峰甚至峰分叉，分離度降低，這些都強(qiáng)烈提示色譜柱受到污染。可采用以下步驟處理：

1 如系統(tǒng)接有在線過濾器和保護(hù)柱，首先排查在線過濾器與保護(hù)柱，進(jìn)行更新替換。日常操作中，當(dāng)壓力升高10%或柱效降低10%時(shí)，就應(yīng)該考慮更換在線過濾器或保護(hù)柱。

2 使用高比例有機(jī)相進(jìn)行沖洗（請(qǐng)注意避免鹽析出、通?？捎锰荻壬叻?，然后維持在高比例甚至100%有機(jī)溶劑條件下）。此操作通?？上慈ゴ蟛糠治廴疚?。

3 如有機(jī)溶劑清洗不能解決問題，可采用如下方法進(jìn)行色譜柱清洗和再生。根據(jù)樣品性質(zhì)及你所了解的污染物性質(zhì)選擇清洗方法，用至少20倍柱體積的HPLC級(jí)溶劑清洗色譜柱，將流動(dòng)相溫度升至35-55℃可提高清洗效率。

注：

1 防止緩沖鹽析出，非極性樣品的沖洗，可以先用高比例異丙醇水沖洗。

2 除非確保您的系統(tǒng)與四氫呋喃和正己烷完全兼容，否則四氫呋喃或正己烷只有在色譜柱無法用反相有機(jī)溶劑如乙腈清洗干凈時(shí)才考慮使用。降低流速及操作溫度，并盡量減少系統(tǒng)在四氫呋喃和乙腈中的暴露時(shí)間。

4 可以考慮對(duì)色譜柱進(jìn)行倒沖，特別是當(dāng)問題表現(xiàn)為壓力急劇升高，提示有顆粒型物質(zhì)直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時(shí)。操作時(shí)，將色譜柱倒接，并與檢測(cè)器斷開，使用低流速0.2ml/min,進(jìn)行過夜沖洗，并封堵檢測(cè)器入口及出口端以免溶劑揮干產(chǎn)生氣泡。