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Bradford 方法

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法(Bradford法)，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。 

一、原理：

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:

(1)靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

(2)測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。

 

此法的缺點(diǎn)是:

(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。

 

二、試劑與器材1.試劑:(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。(2)考馬斯亮蘭G-250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。2.器材:(1)可見(jiàn)光分光光度計(jì) (2)旋渦混合器 (3)試管16支

 

三、操作方法

1.標(biāo)準(zhǔn)方法

(1)取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見(jiàn)下表中的第8、9、10管。

(2)加完試劑2~5分鐘后，即可開(kāi)始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlH2O加5.0mlG-250試劑。注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡。

(3)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。2.微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)(10-100mg/ml)，可將取樣量(包括補(bǔ)加的水)加大到0.5ml或1.0ml，空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0ml H2O，考馬斯亮藍(lán)G-250試劑仍加5.0ml，同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。

 

Folin—酚試劑法（Lowry法）

 

一、實(shí)驗(yàn)原理

這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。

這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。

 

 二、試劑與器材

1.試劑

（1）試劑甲：

（A）10克Na₂CO₃，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC₄H₄O₆·4H₂O）。溶解于500毫升蒸餾水中。

（B）0.5克硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。

（2）試劑乙：

在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na₂WO₄·2H₂O）,25克鉬酸鈉（Na₂MoO₄·2H₂O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰（Li₂SO₄），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。

（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。

2.器材

（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)

（2）旋渦混合器

（3）秒表

（4）試管16支

 

三、操作方法

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。

2.樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。

 

二喹啉甲酸法(BCA法)

一、實(shí)驗(yàn)原理

BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。

 

二、實(shí)驗(yàn)材料  

1.實(shí)驗(yàn)器材 721分光光度計(jì)；恒溫水浴槽；移液管；微量進(jìn)樣器；試管架和試管。 

2.實(shí)驗(yàn)試劑

(1) BCA試劑的配制

① 試劑A，1L：分別稱取10g BCA (1%)，20g Na₂CO₃·H₂O (2%)，1.6g Na₂C₄H₄O₆·2H₂O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO₃ (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO₃調(diào)節(jié)pH值至11.25。

② 試劑B，50ml：取2g CuSO₄·5H₂O (4%)，加蒸餾水至50ml。

③ BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。

(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

(3)樣品溶液：配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。

 

三、實(shí)驗(yàn)操作

1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取試管七支、編號(hào)，按下表操作：

試劑	管號(hào)
	1	2	3	4	5	空白管	測(cè)定管
蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ul）（1.5mg/ml）	20	40	60	80	100
雙蒸水（ul）	80	60	40	20	0	100
待測(cè)樣品（ul）							100
BCA工作液（ml）	2	2	2	2	2	2	2

混勻，37℃保溫30min，用562nm比色，測(cè)定吸光度值

2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。

 

四、該方法的優(yōu)點(diǎn)

(一) 操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；

(二) 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。

(三) 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；

(四) 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響 。