摘要：目的：對血管內皮生長因子抑制劑（VEGF Trap）結合活性試驗兩種結果分析方法進行比較，以考察兩者的差異。方法：采用固定劑量的VEGF與系列稀釋的VEGF Trap處理之后，檢測未結合的VEGF的量，分別以未結合的VEGF量對VEGF Trap濃度梯度和未結合的VEGF檢測板的OD值對VEGF Trap濃度梯度進行四參數(shù)方程擬合，兩種方法計算該產品的結合活性。結果：兩種方法均滿足試驗有效性條件，且血管內皮生長因子抑制劑供試品和標準品的半數(shù)抑制濃度（IC50）均分別為3.68和3.6pmoL·L-1，供試品的結合活性為102%。結論：證明了兩種分析方法得到的結果完全一致。為同類產品結合活性計算方法的選擇提供借鑒。
血管內皮生長因子抑制劑（VEGF Trap）是具有VEGF阻斷作用的重組蛋白，由兩種不同的人VEGF受體VEGFR1和VEGFR2的細胞外區(qū)域融合到人免疫球蛋白IgG1的Fc部分組成。對VEGF-A、VEGF-B和PlGF等因子有較好的親和力。血管內皮生長因子抑制劑通過與上述因子的緊密結合，降低血管通透性，進一步抑制新生血管的生成。目前，該產品已經在美國、歐盟、日本及中國上市，主要用于治療年齡相關性黃斑變性（Age Related Macular Degeneration，AMD）、視網膜靜脈阻塞（Retinal Vein Occlusion，RVO）繼發(fā)黃斑水腫，以及糖尿病黃斑水腫（Diabetic Macular Edema，DME）等[1-4]。
前期已建立了VEGF Trap的質控方法和質控標準用于其質量控制[5-6]。其中結和力是VEGF Trap性能參數(shù)中一個重要的指標，是質量控制的關鍵[7-9]，采用的方法是將固定量的VEGF與系列稀釋的VEGF Trap處理之后，再檢測未結合的VEGF的量，該法雖增加了預先結合的步驟，但下一步檢測時采用商業(yè)化的試劑盒，干擾因素少，商業(yè)化抗體與被檢抗體相互驗證，結果更加真實、客觀[10-11]。
本研究比較了VEGF Trap結合活性試驗中兩種結果的分析方法，以考察兩者之間的差異，為同類產品結合活性試驗結果分析方法的選擇提供借鑒。
1 材料與方法
1.1 試驗材料及儀器
VEGF Trap標準品和一個批次的1支VEGF Trap供試品均為本科室留樣；重組人VEGF165（貨號293-VE）和Quantikine Human VEGF ELISA試劑盒（編號DVE00）均購自美國R&D Systems公司；BSA（編號12659）購自德國默克公司；脫脂奶粉（編號232100）購自美國BD公司；SpectraMax Gemini XS酶標儀及SOFT MAX分析軟件為美國Molecular Devices公司產品。
1.2 結合試驗酶標板的包被
在96孔酶標板每孔加入300 μL封閉劑（含0.1%BSA和5%脫脂奶粉的PBS溶液），于室溫放置至少2 h，使用前用PBS洗滌4次。
1.3 供試品的制備
用稀釋液（含0.1% BSA的PBS溶液）將VEGF Trap標準品和VEGF Trap供試品稀釋至1 nmoL·L-1（其相對分子質量為97000）；將VEGF165稀釋至0.2nmoL·L-1（其相對分子質量為42000），在結合試驗中作為固定量的VEGF165；將VEGF165稀釋至1 nmoL·L-1，用于繪制標準曲線。另配制320 pmoL·L-1和48 pmoL·L-1的VEGF165溶液，用于質控。另取一塊新的96孔酶標板作為稀釋板，在該板中加入用稀釋液制備好的1 nmoL·L-1 VEGF Trap供試品和標準品進行2倍系列稀釋，共10個稀釋度，同時設置空白對照孔，每個供試品做3個重復孔。
1.4 結合板的制備
取包被好的96孔酶標板作為結合板，將稀釋好的VEGF Trap供試品和標準品25 μL加至該板的孔中，每孔再加入165 μL稀釋液和10 μL的0.2nmoL·L-1的VEGF165溶液?；靹?，室溫下孵育12~20 h。
1.5 VEGF165標準曲線及質控孔的制備
用稀釋液對1 nmoL·L-1的重組人VEGF165進行2倍系列稀釋，共7個稀釋度，同時設空白對照孔。取稀釋好的上述溶液10 μL，加至結合板的孔中，每孔加入190 μL稀釋液，用作VEGF165標準曲線制備。在結合板的新孔中再分別加入320和48 pmoL·L-1的VEGF165溶液25 μL，再向各孔中加入175 μL稀釋液，制得40和6 pmoL·L-1的VEGF165溶液，作為試驗中VEGF165溶液高濃度和低濃度質控孔?；靹?，室溫下孵育12~20 h。
1.6 游離VEGF165的檢測
從結合板中取出100 μ L結合液，加入Quantikine® Human VEGF檢測板中，采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明書檢測結合后游離VEGF165。
1.7 結果分析方法
1.7.1 方法一
使用Molecular Devices酶標儀，在450 nm處測定VEGF165檢測板各孔的A值。根據(jù)VEGF165的標準曲線計算VEGF Trap供試品和標準品各濃度梯度下未結合的VEGF165的量。然后以VEGF Trap供試品及標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，對應的VEGF165含量值為縱坐標，進行四參數(shù)方程曲線擬合。計算供試品和標準品的半數(shù)抑制濃度（IC50），按照公式：結合活性（%）=供試品的IC50/標準品的IC50×100%，計算出供試品的結合活性。
1.7.2 方法二
使用Molecular Devices酶標儀，在450 nm處測定VEGF165檢測板各孔的OD值。以VEGF Trap標準品及供試品濃度的對數(shù)值為橫坐標，OD450值為縱坐標，進行四參數(shù)方程曲線擬合。計算標準品和供試品的半數(shù)抑制濃度（IC50），按照公式：相對結合力（%）=供試品的IC50/標準品的IC50× 100%，計算出供試品的結合活性。
1.8 試驗有效性
VEGF標準曲線線性回歸分析R2值必須不低于0.98；40 pmoL·L-1VEGF165質控的3個重復孔中，應有2個在28~52 pmoL·L-1；6 pmoL·L-1 VEGF165質控的3個重復孔中，應有2個4~9 pmoL·L-1。標準品與供試品結合曲線的非線性回歸分析R2值必須不低于0.98；標準品的IC50值必須在2~5 pmoL·L-1。只有同時滿足上述條件時，才視為試驗有效。按下式計算VEGF Trap的相對結合力，65%~135%為合格。
2 結果
2.1 方法一
在450 nm下測定結合板每一個孔的吸光度值。根據(jù)VEGF165標準品的濃度值及吸光度值繪制VEGF165標準曲線，分別計算出質控點VEGF Trap供試品和標準品各濃度梯度下未結合的VEGF165的量，結果如表 1及表 2所示。
表 1 VEGF Trap標準品各濃度梯度下未結合的VEGF165的量
表 2 VEGF Trap供試品各濃度梯度下未結合的VEGF165的量
VEGF165標準曲線線性回歸方程：Y=0.081+0.028x，R2值為0.999，曲線如圖 1所示；VEGF165標準品各個濃度與吸光度值的對應關系如表 3所示；40 pmoL·L-1VEGF165質控的3個重復孔值分別為46.12、46.31、43.66 pmoL·L-1；6 pmoL·L-1 VEGF165質控的3個重復孔值分別為5.32、5.69、6.10 pmoL·L-1。以VEGF Trap供試品及標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，對應的VEGF165含量值為縱坐標，進行四參數(shù)方程曲線擬合，分別繪制供試品和標準品的曲線，求出供試品和標準品的半數(shù)抑制濃度分別為3.68和3.6 pmoL·L-1，標準品與供試品結合曲線的非線性回歸分析方程：Y=9.961/（1+x/3.68）2.11+0.639，R2值為0.997，如圖 2所示。以上均滿足該試驗的有效性條件，所以試驗有效。計算供試品的結合活性為102%。
圖 1 VEGF165標準曲線
表 3 VEGF165標準品濃度及吸光度值
圖 2 未結合的VEGF165與VEGF Trap濃度對應關系曲線
2.2 方法二
在450 nm直接測定VEGF165檢測板各孔的吸光度值。直接以VEGF Trap標準品及供試品濃度的對數(shù)值為橫坐標，OD450值為縱坐標，進行四參數(shù)方程曲線擬合，曲線如圖 3所示。標準品與供試品結合曲線的非線性回歸分析的R2值分別為0.997?；貧w方程：y=0.2771/（1+x/3.68）2.11+0.0989。計算供試品和標準品的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為3.68和3.6 pmoL·L-1，VEGF165標準曲線和各個質控孔的值同上。均滿足試驗有效性條件，計算供試品的結合活性為102%。
圖 3 未結合的VEGF165吸光度值與VEGF Trap濃度對應關系
3 討論
經過兩種方法的對比表明，以VEGF Trap標準品及供試品濃度的對數(shù)值為橫坐標，以未結合的VEGF165的量值或直接以未結合的VEGF165的吸光度值為縱坐標，計算得到的VEGF Trap的結合活性一致。
結合活性的計算方法為待測供試品與標準品IC50（半數(shù)抑制濃度）之比，而半數(shù)抑制濃度為縱坐標是S形曲線上下漸近線差值中點時，橫坐標所表示的值，即其所對應的VEGF Trap濃度；理論上，無論以未結合的VEGF165的量值或直接以未結合的VEGF165的吸光度值為縱坐標，兩者所得到的橫坐標即對應的VEGF Trap濃度一致，縱坐標VEGF165的量值或未結合的VEGF165的吸光度值本身存在著一定的y=kx+b的直線關系，計算半數(shù)抑制濃度時，利用了上下漸近線的差值，使得b值被消除，所以方法一和方法二得到的曲線實際上只是縱坐標被放大了k倍，而對應的橫坐標相同，這是兩種方法得到相同的結合活性的理論依據(jù)。
本研究中，方法二計算上操作簡便，不用再將VEGF165的OD值轉換成VEGF165的含量值；方法一，雖然要經過計算未結合的VEGF165這一步驟，但轉換后四參數(shù)的圖形的縱坐標變大，且直接以未結合的VEGF165的量來表示更加直觀。目前，SoftMax公司有專門的軟件GXP，能夠通過OD值直接轉換成VEGF165的含量值，并繪制VEGF165的含量值對VEGF Trap濃度的四參數(shù)曲線，十分方便，但需單獨購買該軟件，需要一定的成本。
本研究比較了用于VEGF Trap結合力試驗的兩種計算方法，結果表明，兩種方法結果一致，在實踐中具體采用哪種方法，可根據(jù)實際情況而定。
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