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水是藥品生產(chǎn)中用量大、使用廣的一種輔料，用于生產(chǎn)過程及藥物制劑的制備。水在純化、貯存和使用過程中，容易被微生物污染，微生物或其代謝產(chǎn)物會嚴(yán)重影響藥品質(zhì)量，引起不良后果。目前，《中國藥典》、《美國藥典》、《英國藥典》、《歐洲藥典》均收載了制藥用水的微生物檢查方法，但其所用培養(yǎng)基存在較大差異。筆者采用不同培養(yǎng)條件，進(jìn)口和國產(chǎn)2種培養(yǎng)基(TSA培養(yǎng)基和R2A培養(yǎng)基），薄膜過濾法和平皿法2種實(shí)驗(yàn)方法，分別對采集自陜西4家制藥單位的不同水系統(tǒng)的20份樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。為得到具有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)據(jù)，本次實(shí)驗(yàn)盡可能考慮了微生物污染水平，從預(yù)估污染嚴(yán)重的取水口連續(xù)取樣1000mL至滅菌瓶中，及時送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。通過比較中外藥典制藥用水微生物檢查法的差異，為《中國藥典》的修訂提供參考，為推動制藥用水檢查法與國際接軌提供合理化建議，優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)。

1、儀器與試藥

1.1儀器LRH-250型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司）；LRH-150B型生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠）；SHH-250JS型霉菌培養(yǎng)箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠）；MLS-3020型高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋公司）。

1.2試藥TSA培養(yǎng)基(MerckKGaA德國默克公司，批號VM440558232)；TSA培養(yǎng)基(青島海博高科園生物技術(shù)有限公司，批號20120730)；R2A培養(yǎng)基（MerckKGaA德國默克公司，批號VM401316218)；R2A培養(yǎng)基(青島海博高科園生物技術(shù)有限公司，批號20120730)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司，批號120425)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司，批號1111022)；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京三藥科技開發(fā)公司，批號120509)。以上培養(yǎng)基和稀釋液采用規(guī)定的滅菌程序進(jìn)行高壓蒸汽滅菌備用，培養(yǎng)基的適用性檢查符合《中國藥典》2010年版規(guī)定。水樣品20份每份1000mL。

2、方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)方法取每份水樣品，搖勻，薄膜過濾法，100mL/膜，過濾，不沖洗，制備4份薄膜，分別貼于預(yù)先制備好的進(jìn)口及國產(chǎn)TSA、R2A培養(yǎng)基平皿上，A、B、E、F檢測條件各制備1張薄膜。采用平皿法，分別量取相同水樣1.0mL，置于8個無菌平皿中，分別傾倒預(yù)熱至45V的進(jìn)口及國產(chǎn)TSA、R2A培養(yǎng)基，搖勻，C、D、G、H檢測條件各平行制備2個平皿。另外取水樣，1mL/膜，加人100mL稀釋液中，薄膜過濾法，過濾，不沖洗，分別貼于預(yù)先制備的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，按I、J檢測條件培養(yǎng)。以上平皿按表1檢測條件培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果，規(guī)定平皿法所測數(shù)值保留小數(shù)點(diǎn)后1位，薄膜過濾法取樣量為100mL時，需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后保留小數(shù)點(diǎn)后1位進(jìn)行比較分析。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果20份水樣品在不同培養(yǎng)條件下的計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對不同培養(yǎng)條件進(jìn)行兩兩配對的t檢驗(yàn)，P值大于0.05表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反之，則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.1比較進(jìn)口與國產(chǎn)TSA、R2A培養(yǎng)基2種培養(yǎng)條件的計(jì)數(shù)結(jié)果A與B、C與D、E與F、G與H進(jìn)行兩兩配對的樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明本次實(shí)驗(yàn)國產(chǎn)與進(jìn)口的同種培養(yǎng)基兩兩之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.2比較R2A和TSA培養(yǎng)基2種培養(yǎng)條件的計(jì)數(shù)結(jié)果A與E、B與F、C與G、D與H進(jìn)行兩兩配對的t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，采用進(jìn)口R2A和TSA培養(yǎng)基，薄膜過濾法，檢測結(jié)果A與E差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；采用國產(chǎn)R2A和TSA培養(yǎng)基，薄膜過濾法，檢測結(jié)果B與F差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，且R2A培養(yǎng)基檢測數(shù)據(jù)高于TSA培養(yǎng)基；采用國產(chǎn)和進(jìn)口TSA和R2A培養(yǎng)基，平皿法，不同種培養(yǎng)基的檢測結(jié)果C與G、D與H差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，且R2A培養(yǎng)基的檢測結(jié)果高于TSA培養(yǎng)基。

2.2.3比較TSA、R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)條件與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的計(jì)數(shù)結(jié)果D與I、H與I進(jìn)行兩兩配對的t檢驗(yàn)，結(jié)果D與I差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，說明取樣量1mL，薄膜過濾法/平皿法處理后，均采用國產(chǎn)培養(yǎng)基，檢測結(jié)果明顯不同，且營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測結(jié)果高于TSA培養(yǎng)基，H與I差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)，說明采用平皿法R2A培養(yǎng)基檢測結(jié)果與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測結(jié)果相似。

2.2.4比較數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，薄膜過濾法1mL，TSA、R2A與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的計(jì)數(shù)結(jié)果由于B與I、F與I的取樣量不一致，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，對B與I、F與I進(jìn)行兩兩配對的t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，結(jié)合表1數(shù)據(jù)，說明采用薄膜過濾法TSA、R2A、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測結(jié)果有明顯差異，且營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測數(shù)值較高。

2.2.5比較數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，同種培養(yǎng)基薄膜過濾法與平皿法的計(jì)數(shù)結(jié)果由于A與C、B與D、E與G、F與H的取樣量不一致，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，對A與C、B與D、E與G、F與H進(jìn)行兩兩配對的t檢驗(yàn)，結(jié)果A與C、B與D差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)，說明采用TSA培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，方法的選擇對檢測結(jié)果影響不大；E與G、F與H差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，結(jié)合表1，說明采用R2A培養(yǎng)基平皿法檢測結(jié)果較高。

2.2.6綜合比較提供低營養(yǎng)環(huán)境的R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)所得菌落數(shù)值高于TSA培養(yǎng)基，檢出率較高。即：R2A培養(yǎng)基，30?35V,120h，薄膜過濾法/平皿法，培養(yǎng)效果較好。同時，按《中國藥典》2010年版的方法檢測菌落數(shù)值較高，方法可行。

3、討論

制藥用水微生物檢查法，《歐洲藥典》采用低營養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)條件有良好的促生長能力，有利于微生物的檢出，但其菌落形態(tài)較小不利于計(jì)數(shù)，而且培養(yǎng)時間長；《美國藥典》采用TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)條件，在水樣低污染時其促生長優(yōu)勢不明顯，中等或較嚴(yán)重污染時，其促細(xì)菌生長能力較好，且菌落形態(tài)典型，易于觀察計(jì)數(shù)；《中國藥典》2010年版收載的方法可行，但是營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不太典型，不如TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)所得菌落計(jì)數(shù)明顯。本次實(shí)驗(yàn)中玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落經(jīng)確證均為細(xì)菌，且菌落數(shù)普遍少于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上所得菌落數(shù)，為避免重復(fù)計(jì)數(shù)，僅采用營養(yǎng)瓊脂平皿上的菌落數(shù)分析統(tǒng)計(jì)。

《美國藥典》、《歐洲藥典》、《英國藥典》、《中國藥典》對制藥用水的限度規(guī)定均為不得過100cfu•mL1，但由于培養(yǎng)基系統(tǒng)不同，是否能夠真實(shí)地反映污染程度，提高方法的靈敏度非常重要。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，低營養(yǎng)條件的R2A培養(yǎng)基，薄膜過濾法/平皿法，30?35V,120h，有利于微生物的檢出。

本研究參考國外藥典及相關(guān)文獻(xiàn)報道，TSA、R2A和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均選擇培養(yǎng)溫度30?35V，高營養(yǎng)的TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)時間為72h,低營養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)時間為120h，延長培養(yǎng)時間有利于微生物的檢出，故選擇培養(yǎng)時間為120h,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基依據(jù)枟中國藥典》2010年版的規(guī)定時間培養(yǎng)。由于制藥用水的污染情況未知，取樣量為100mL時，可能會導(dǎo)致無法計(jì)數(shù)的問題，取樣量為1mL時，可能由于取樣量小，無法真實(shí)反映污染情況?？筛鶕?jù)預(yù)估情況，取樣量為1mL時，薄膜過濾法/平皿法均可行，取樣量大于1mL時，宜采用薄膜過濾法。建議修訂取樣量為10mL，兼顧到取樣的代表性和檢測結(jié)果的可靠性。

在本研究中，采用《中國藥典》2010年版方法進(jìn)行的檢測數(shù)值普遍較大，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)前充分考慮到選擇污染較嚴(yán)重的水系統(tǒng)，而且不同培養(yǎng)基對不同細(xì)菌的選擇性不同導(dǎo)致結(jié)果差異，這一問題需要進(jìn)一步調(diào)查研究。

從微生物的危害性角度出發(fā)，在提高細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)這些反映總體衛(wèi)生情況的檢查方法靈敏度的同時，更需關(guān)注其致病菌存在的可能。

ICH地區(qū)互換使用微生物檢驗(yàn)相關(guān)藥典方法

The harmonisation of the ICH guideline Q4B Annex 4A onevaluation and recommendation of pharmacopoeial texts for use in the ICH regions on micro enumeration and tests for specified micro-organisms has also been completed with step 5. TheInternational Council for Harmonisation (ICH) has been working on theharmonisation of the requirements of the Pharmaocopoeias in the regions of theEU, the U.S. and Japan for several years already. Based on the evaluation bythe Q4B Expert Working Group (EWG), the ICH Steering Committee has recommendedthat the official pharmacopoeial texts on Microbial Enumeration,

微生物計(jì)數(shù)法和致病菌檢驗(yàn)在ICH地區(qū)所用藥典協(xié)調(diào)已達(dá)成第5階段。ICH已經(jīng)在歐盟、美國和日本藥典要求統(tǒng)一方面工作數(shù)年?；赒4B專家工作組（EWG）的評估，ICH專家委員聲明以下官方藥典內(nèi)容：

• Ph.Eur. 2.6.12. Microbiological     Examination of Non-Sterile Products: Microbial Enumeration Tests,

  歐洲藥典2.6.12，非無菌藥品微生物檢驗(yàn)：微生物計(jì)數(shù)法

• JP 4.05 Microbiological Examination of     Non-Sterile Products: I. Microbiological Examination of Non-Sterile     Products: Microbial Enumeration Tests, and

  日本藥典4.05 非無菌藥品微生物檢查：I、非無菌藥品的微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法，以及

• USP <61> Microbiological     Examination of Nonsterile Products

  美國藥典<61>非無菌藥品的微生物檢查

can be used interchangeably in the ICH regions.

可以在ICH地區(qū)互換使用。

• Ph.Eur. 2.6.13. Microbiological     Examination of Non-Sterile Products: Tests for Specified Micro-organisms,

  歐洲藥典2.6.13，無菌藥品微生物檢驗(yàn)：致病菌檢驗(yàn)

• JP 4.05 Microbiological Examination of     Non-Sterile Products: II. Microbiological Examination of Non-Sterile     Products: Tests for Specified Micro-organisms, and

  日本藥典4.05 非無菌藥品微生物檢驗(yàn)：II、非無菌藥品的微生物檢驗(yàn)：致病菌檢驗(yàn)，以及

• USP <62> Microbiological     Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms

  美國藥典<62>非無菌藥品的微生物檢驗(yàn)：致病菌檢驗(yàn)

can be used as interchangeable in the ICH regions.

可以在ICH地區(qū)互換使用。

As always with ICH harmonisation processes, there is an addition stating that the FDA may request a demonstration that the chosenmethod is acceptable and suitable for a specific material or product,irrespective of its origin. The European Union states: "For the European Union, the monographs of the Ph. Eur. have mandatory applicability.Regulatory authorities can accept the reference in a marketing authorisation application, renewal or variation application citing the use of the corresponding text from another pharmacopoeia as referenced in Section 2.1, inaccordance with the conditions set out in this annex, as fulfilling therequirements for compliance with the Ph. Eur. Chapter 2.6.12. on the basis ofthe declaration of interchangeability made above.."

正如所有ICH協(xié)調(diào)流程一樣，還有一附加聲明：FDA可能需要證明所選的方法是可接受的，并且適合于特定物料或藥品，而不管其處于何地區(qū)。歐洲則聲明：“對于歐盟，歐洲藥典的各論具有強(qiáng)制適用性。注冊機(jī)構(gòu)可以接受在上市許可申報、更新或變更申報中引用對另一藥典的相應(yīng)內(nèi)容，即2.1部分的引用，基于上述互換聲明，只要符合本附錄中設(shè)定條件，滿足歐洲藥典2.6.12符合性要求即可。”