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9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則

 

藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證(analytical method validation)的目的是證明采用建立的方 法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證;在藥品生產(chǎn)工藝變 更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗(yàn)證。在建 立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、變更藥品生產(chǎn)工藝或制劑組分、修訂原分析方法時(shí)，需對(duì)分析方法進(jìn)行 驗(yàn)證。方法驗(yàn)證的理由、過(guò)程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說(shuō)明或修訂說(shuō)明中。生 物制品質(zhì)量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測(cè)定方法，其中理化分析方法的 驗(yàn)證原則與化學(xué)藥品基本相同，所以可參照本指導(dǎo)原則進(jìn)行，但在進(jìn)行具體驗(yàn)證時(shí)還需要 結(jié)合生物制品的特點(diǎn)考慮;相對(duì)于理化分析方法而言，生物學(xué)測(cè)定方法存在更多的影響因 素，因此本指導(dǎo)原則不涉及生物學(xué)測(cè)定方法驗(yàn)證的內(nèi)容。

驗(yàn)證的分析項(xiàng)目有:鑒別試驗(yàn)、限量或定量檢查、原料藥或制劑中有效成分含量測(cè)定， 以及制劑中其他成分(如防腐劑等，中藥中其他殘留物、添加劑等)的測(cè)定。藥品溶出度、 釋放度等檢查中，其溶出量等的測(cè)定方法也應(yīng)進(jìn)行必要驗(yàn)證。鑒別試驗(yàn)、雜質(zhì)測(cè)定(限度 或定量分析)、含量測(cè)定和特性參數(shù)(如:藥物溶出度、釋放度等)。

驗(yàn)證的指標(biāo)有:專屬性、準(zhǔn)確度、精密度(包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性)、專屬 性、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍和耐用性。在分析方法驗(yàn)證中，須用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。由于分析方法具有各自的特點(diǎn)，并隨分析對(duì)象而變化，因此需要視具體情況擬訂驗(yàn)證的指 標(biāo)。表 1 中列出的分析項(xiàng)目和相應(yīng)的驗(yàn)證指標(biāo)可供參考。

方法驗(yàn)證內(nèi)容如下。

三一、專屬性

專屬性系指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的分析方法 能正確測(cè)定出被測(cè)物的能力。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢査和含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)采用多種不同原理的方法予以補(bǔ)充。

1. 鑒別反應(yīng)

應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似的化合物。不含被測(cè)成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈陰性反應(yīng)。

2. 含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定

采用的色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說(shuō)明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明各成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。

在雜質(zhì)對(duì)照品可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察各成分包括雜質(zhì)之間能否得到分離。

在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測(cè)定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證了的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸(堿)水解或氧化的方法進(jìn)行加速破壞，以研究可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定的影響。含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢査應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行峰純度檢查。

一二、準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度系指采用該所建立方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，一般用回收 率(%)表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)測(cè)定試驗(yàn)。準(zhǔn)確度也可由所測(cè)定的精密度、 線性和專屬性推算出來(lái)。

1. 化學(xué)藥含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

原料藥采用對(duì)照品可用已知純度的對(duì)照品或供試品進(jìn)行測(cè)定，或用所得所測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測(cè)制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或用所建立方法的測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一種個(gè)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

準(zhǔn)確度也可由所測(cè)定的精密度、線性和專屬性推算出來(lái)。

2. 化學(xué)藥雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度

可向原料藥或制劑處方量空白輔料中加入已知量雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到雜 質(zhì)或降解產(chǎn)物對(duì)照品，可用所建立的方法測(cè)定的結(jié)果與另一成熟的方法(如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法 或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法。在不能測(cè) 得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的校正因子或不能測(cè)得對(duì)主成分的相對(duì)校正因子的情況下，可用不加校 正因子的主成分自身對(duì)照法主成分的校正因子計(jì)算雜質(zhì)含量。，并應(yīng)明確表明單個(gè)雜質(zhì)和 雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重量比(%)或面積比(%)。

3. 中藥化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

可用已知純度的對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定，即向已知被測(cè)成分含量的供試品中再精 密加入一定量的已知純度的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差， 除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè) 成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi);加入的對(duì)照品的量要適當(dāng)，過(guò)小則引起較 大的相對(duì)誤差，過(guò)大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。

回收率%=(C−A)⁄B×100%

式中 A 為供試品所含被測(cè)成分量;B 為加入對(duì)照品量;

C 為實(shí)測(cè)值。4. 校正因子的準(zhǔn)確度 對(duì)色譜方法而言，絕對(duì)(或定量)校正因子是指單位面積的色譜峰代表的待測(cè)物質(zhì)的量。待測(cè)定物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比，即為相對(duì)校正因子。相對(duì)校正 因子計(jì)算法常應(yīng)用于化學(xué)藥有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定、中藥材及其復(fù)方制劑中多指標(biāo)成分的測(cè)定。校正因子的表示方法很多，本指導(dǎo)原則中的校正因子是指氣相色譜法和髙效液相色譜法中的相對(duì)重量校正因子。

 

相對(duì)校正因子可采用替代物(對(duì)照品)和被替代物(待測(cè)物)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值進(jìn)行比較獲得;采用紫外吸收檢測(cè)器時(shí)，可將替代物(對(duì)照品)和被替代物(待測(cè)物)在規(guī)定波長(zhǎng)和溶劑條件下的吸收系數(shù)比值進(jìn)行比較，計(jì)算獲得。

4. 數(shù)據(jù)要求

在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度(相當(dāng)于 100%濃度水平)的供試品，用至少 6 份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià);或設(shè)計(jì) 3 種不同濃度，每種濃度分別制備 3 份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用至少 9 份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。兩種方法的選定應(yīng)考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。

對(duì)于化學(xué)藥，一般中間濃度加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在 1:1 左右， 建議高、中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在 1.2:1，1:1，0.8:1 左右，應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率(%)，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間(置信度一般為 95%);對(duì)于中藥，一般中間濃度加入量與所取供試品中 待測(cè)定成分量之比控制在 1:1 左右，建議高、中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待 測(cè)定成分量之比控制在 1.5:1，1:1，0.5:1 左右，應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、 對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率(%)計(jì)算值，以及回收率(%)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%) 或置信區(qū)間。對(duì)于校正因子，應(yīng)報(bào)告測(cè)定方法、測(cè)定結(jié)果和 RSD%。樣品中待測(cè)定成分含 量和回收率限度關(guān)系可參考表 2(準(zhǔn)確度與被分析物的性質(zhì)、基質(zhì)復(fù)雜程度、樣品溶液的制備和檢測(cè)方法等密切相關(guān)，在限度設(shè)定時(shí)應(yīng)充分考慮)。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于 0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當(dāng)放寬。美國(guó)藥典論壇 PF39(6) <1200> Requirements ForCompendialValidation 中，準(zhǔn)確度可接受標(biāo)準(zhǔn):回收率=100%±2C-0.1505%，其中C為待 測(cè)定成分含量。

二三、精密度

精密度系指在規(guī)定的測(cè)定條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性;在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度;在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。

含量測(cè)定和雜質(zhì)的定量測(cè)定應(yīng)考察方法的精密度。

1. 重復(fù)性

在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度(分析方法擬定的樣品測(cè)定濃度，相當(dāng)于 100%濃度水平) 的供試品，用至少測(cè)定 6 份的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià);或設(shè)計(jì) 3 種不同濃度，每種濃度分別制 備 3 份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用至少 9 份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用至少 9 份測(cè)定結(jié) 果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。對(duì)于化學(xué)藥，一般中間濃度加入量與 所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在 1:1 左右，建議高、中、低濃度對(duì)照品加入量與所 取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在 1.2:1，1:1，0.8:1 左右，對(duì)于中藥，一般中間濃度加 入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在 1:1 左右，建議高、中、低濃度對(duì)照品加入 量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在 1.5:1，1:1，0.5:1 左右。

2. 中間精密度

考察隨機(jī)變動(dòng)因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)精密度的影響，應(yīng)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。

3. 重現(xiàn)性

國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，如通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)室協(xié)同檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過(guò)程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說(shuō)明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)所用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運(yùn)輸中的環(huán)境對(duì)該一致性的影響，以免影響重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果。

4. 數(shù)據(jù)要求

均應(yīng)報(bào)告偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測(cè)定成分含量和精密 度 RSD 可接受范圍參考表 3(計(jì)算公式，重復(fù)性:RSD r= C-0.15;重現(xiàn)性:RSDR = 2C-0.15， 其中 C 為待測(cè)定成分含量)，可接受范圍可在給出數(shù)值 0.5~2 倍區(qū)間(精密度與被分析物 的性質(zhì)、基質(zhì)復(fù)雜程度、樣品溶液的制備和檢測(cè)方法等密切相關(guān)，在限度設(shè)定時(shí)應(yīng)充分考慮)。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于 0.01%及多成分等分析中，精密度限度可適當(dāng)放寬。

 

四、檢測(cè)限

檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。藥品的鑒別試驗(yàn)和雜質(zhì)檢査方法，均應(yīng)通過(guò)測(cè)試確定方法的檢測(cè)限。檢測(cè)限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒(méi)有定量意義。常用的方法如下。

1. 直觀法 用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。

2. 信噪比法 用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的被測(cè)物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為 3:1或 2:1 時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。

3. 基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

按照LOD=3.3δ/S 公式計(jì)算。式中LOD:檢測(cè)限;δ:響應(yīng)值的偏差;S:標(biāo)準(zhǔn)曲線的 斜率。

δ 可以通過(guò)下列方法測(cè)得:1(1)測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;2(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余 標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)代替。

4. 數(shù)據(jù)要求

上述計(jì)算方法獲得的檢測(cè)限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)定圖譜，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。

五、定量限

定量限系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度 要求。對(duì)微量或痕量藥物分析、定量測(cè)定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)確定方法的定量限。常用的方法如下。

1. 直觀法 用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地定量測(cè)定的最低濃度或量。 2. 信噪比法 用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把將已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地定量的被測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為 10:1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。

 

3. 基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

按照 LOQ = 10δ/S 公式計(jì)算。式中 LOQ:定量限;δ:響應(yīng)值的偏差;S:標(biāo)準(zhǔn)曲線的 斜率。

δ 可以通過(guò)下列方法測(cè)得:1(1)測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;2(2)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的 剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)代替。

4. 數(shù)據(jù)要求

上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)試圖譜，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

六、線性

線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值結(jié)果響應(yīng)值或其經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化的形式與試樣中被測(cè)物濃度直接呈比例關(guān)系的程度。

應(yīng)在規(guī)定設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系。可用同一對(duì)照品貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精 密稱取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備 5 份種不同濃度的供試 樣品。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法 進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算。或者可采用描述 濃度-響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。

數(shù)據(jù)要求:應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、殘差平方和、和線性圖(或其他它數(shù)學(xué)模型)。

七、范圍

范圍系指分析方法能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。

范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。原料藥 和制劑含量測(cè)定，范圍一般為測(cè)定濃度的 80%~120%;制劑含量均勻度檢査，范圍一般為 測(cè)定濃度的 70%~130%, 特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當(dāng)放寬;溶出度或釋放 度中的溶出量測(cè)定，范圍一般為限度的±30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的-20%至 上限的+20%;雜質(zhì)測(cè)定，范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，擬訂為雜質(zhì)報(bào)告水平至規(guī)定限 度的 120%規(guī)定限度的±20%。如果含量測(cè)定與雜質(zhì)檢查同時(shí)進(jìn)行，用峰面積歸一化法進(jìn)行 計(jì)算，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20%至含量限度(或上限)的+20%。

在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。

校正因子測(cè)定時(shí)，范圍一般應(yīng)根據(jù)其應(yīng)用對(duì)象的測(cè)定范圍確定。

八、耐用性

耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方 法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開(kāi)始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)定試條件要 求苛刻，則應(yīng)在方法中寫(xiě)明，并注明可以接受變動(dòng)的范圍，可以先采用均勻設(shè)計(jì)確定主要 影響因素，再通過(guò)單因素分析等確定變動(dòng)范圍。典型的變動(dòng)因素有:被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、 樣品的提取次數(shù)、時(shí)間等。高效液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有:流動(dòng)相的組成和 pH 值、 不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。氣相色譜法變動(dòng)因素有:不同品牌 或批號(hào)的色譜柱、固定相、不同類型的擔(dān)體、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。

經(jīng)試驗(yàn)，測(cè)定條件小的變動(dòng)應(yīng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法的可靠性。