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奧硝唑為目前常用的抗厭氧菌藥物，作為繼甲硝唑和替硝唑后的第三代抗厭氧菌感染藥物，療效穩(wěn)定，副作用小[1-2]。左奧硝唑作為奧硝唑的單一對(duì)映體，與現(xiàn)有的奧硝唑相比，其副反應(yīng)更小[3]。但臨床上使用的奧硝唑、左奧硝唑水溶性極差，做成輸液制劑時(shí)pH值在3.5左右（人體耐受pH為4.0~9.0），患者用藥時(shí)易產(chǎn)生靜脈炎[4-5]，且輸液高溫滅菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生較高的毒性降解產(chǎn)物2-甲基-5硝基咪唑[6]，臨床用藥安全性較差。磷酸左奧硝唑酯二鈉是對(duì)左奧硝唑進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾形成的新的化合物[7-8]，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明磷酸左奧硝唑酯二鈉在體內(nèi)可以迅速分解為左奧硝唑[9]。磷酸左奧硝唑酯二鈉制備成靜脈給藥制劑時(shí)提高了藥物的水溶性，pH值為5.5左右，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明不會(huì)產(chǎn)生靜脈炎[10-11]，且雜質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)不會(huì)產(chǎn)生毒性降解產(chǎn)物2-甲基-5硝基咪唑[12]。磷酸左奧硝唑酯二鈉為注射用磷酸左奧硝唑酯二鈉的原料藥，現(xiàn)根據(jù)《中華人民共和國藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》）2015年版通則1143[13]對(duì)磷酸左奧硝唑酯二鈉進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究，為建立該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供科學(xué)依據(jù)。

 

1 材料

 

1.1 儀器

TAL-40D型干式恒溫器（湛江安度斯生物有限公司）；IKA MS3型自動(dòng)漩渦混合器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；FED400型干燥箱（德國賓德公司）；XSE205DU型電子天平（梅特勒-托利多公司）；其他器皿包括試管、微量移液器及微量移液器配套的槍頭（無熱原）等。

 

1.2 藥品與試劑

磷酸左奧硝唑酯二鈉（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇海慈生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)18011001、18011101、18011201）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，0.25 EU·mL-1，批號(hào)1901161；0.125 EU·mL-1，批號(hào)1901212。福州新北生化工業(yè)有限公司，0.25 EU·mL-1，批號(hào)18040712；0.125 EU·mL-1，批號(hào)18090512；規(guī)格0.1 mL/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)150601-201885，規(guī)格80 EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)1812210，規(guī)格50 mL/瓶）。

 

2 方法與結(jié)果

 

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

 

根據(jù)4批鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET水溶解，置漩渦混合器上混勻15 min，然后制成濃度為2 λ、1λ、0.5 λ和0.25 λ 4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混合30 s，按《中國藥典》2015年版通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[5]復(fù)核本試驗(yàn)所用鱟試劑的靈敏度，結(jié)果4批鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）均在0.5 ~ 2.0 λ范圍內(nèi)，符合《中國藥典》規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，詳見表 1和表 2。

 

表 1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果（0.25 EU·mL-1）

 

 

 

 表 2 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果（0.125 EU·mL-1）

 

2.2 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

 

根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（《中國藥典》2015年版二部附錄Ⅺ E），L=K/M，K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量。本品制成注射劑規(guī)格為0.2 g/支，臨床用藥量為每日8支，使用方式為靜脈滴注，給藥時(shí)間為1~2 h，故擬使用日劑量為1600 mg·h-1。則K=5 EU/（kg·h），供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體質(zhì)量（M），人體表面積按1.62 m2計(jì)算，L=0.19 EU·mg-1。為保證用藥安全，本企業(yè)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素限值嚴(yán)格控制，至計(jì)算值的1/5，確定磷酸左奧硝唑酯二鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為每1 mg中含有內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.04 EU。

 

稱取供試品適量，加BET水溶解，配成初始濃度c=50 mg·mL-1的供試品溶液，按《中國藥典》2015年版通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[5]的規(guī)定，MVD=cL/λ，計(jì)算各靈敏度鱟試劑對(duì)應(yīng)的樣品最大有效稀釋倍數(shù)：MVD0.25=8（6.25 mg·mL-1）、MVD0.125=16（3.125 mg·mL-1）、MVD0.06=32（1.562 mg·mL-1）、MVD0.03=64（0.781 mg·mL-1）；在不超過對(duì)應(yīng)MVD的稀釋倍數(shù)下進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

 

2.3 預(yù)干擾試驗(yàn)

 

用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑，對(duì)不超過64倍稀釋（即不低0.781 mg·mL-1）的不同濃度的供試品溶液進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，以確定樣品的不干擾濃度。稱取磷酸左奧硝唑酯二鈉242.30 mg，批號(hào)：18011001，加4.85 mL BET水溶解，配成初始濃度c=50 mg·mL-1的供試品溶液，再將供試品溶液稀釋至不超過MVD的一系列稀釋倍數(shù)，分別為8倍、16倍、32倍、64倍，得一系列稀釋濃度：c1=6.25 mg·mL-1，c2=3.125 mg·mL-1，c3=1.562 mg· mL-1，c4=0.781 mg·mL-1。對(duì)這些濃度的供試品溶液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)預(yù)干擾試驗(yàn)，將供試品溶液記作NPC，供試品陽性對(duì)照溶液記作PPC，同時(shí)做2支陽性對(duì)照管PC及2支陰性對(duì)照管NC，結(jié)果見表 3。

 

表 3 樣品預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果

 

由表 3結(jié)果可知，供試品溶液（原液）的稀釋濃度在0.781~6.25 mg·mL-1時(shí)，對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)無干擾作用，且試驗(yàn)結(jié)果有效。則可選用靈敏度不低于0.25 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。

 

2.4 干擾試驗(yàn)

 

根據(jù)預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，選用靈敏度為0.125 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。稱取3個(gè)批號(hào)的磷酸左奧硝唑酯二鈉，加BET水溶解得初始濃度c=50 mg·mL-1的供試品溶液，再用BET水稀釋至對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)無干擾濃度的供試品溶液c=6.25 mg·mL-1。將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品用BET水逐步配制成5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即4 λ（0.5 EU·mL-1）、2 λ（0.25 EU·mL-1）、λ（0.125 EU·mL-1）、0.5 λ（0.0625 EU·mL-1）、0.25λ（0.0312 EU·mL-1）。按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果見表 4。

 

表 4 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果

  

由表 4結(jié)果可知，平行3批次干擾試驗(yàn)中，陰性對(duì)照溶液NC、供試品溶液NPC的所有平行管均為陰性；兩個(gè)廠家鱟試劑標(biāo)示靈敏度對(duì)照系列的結(jié)果λc在0.5 λ~2 λ之間（包括0.5 λ和2 λ），符合鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)要求，試驗(yàn)有效。兩個(gè)廠家鱟試劑干擾試驗(yàn)系列的結(jié)果Et在0.5 λ~2 λ之間（包括0.5 λ和2 λ），符合規(guī)定。說明供試品溶液稀釋至6.25 mg·mL-1時(shí)，采用靈敏度λ為0.125 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)無干擾，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

其中：Xs，Xt分別為鱟試劑標(biāo)示靈敏度對(duì)照溶液和干擾試驗(yàn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。

 

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

 

稱取3個(gè)批號(hào)的供試品，加BET水溶解，配成50 mg·mL-1的供試品溶液。分別再用BET水稀釋8倍，使用λ為0.125 EU·mL-1的鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司），按所建立方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表 5。

 

表 5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

 

由表 5結(jié)果可知，陰性對(duì)照溶液NC的平行管都為陰性，陽性對(duì)照溶液PC的平行管都為陽性，供試品陽性溶液PPC的平行管都為陽性時(shí)，試驗(yàn)有效。供試品溶液NPC的平行管都為陰性，供試品符合規(guī)定。

 

3 討論

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法作為替代熱原檢查法的一種檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。通過預(yù)干擾試驗(yàn)可以分析不同樣品質(zhì)量濃度對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度，初步篩選出對(duì)內(nèi)毒素反應(yīng)無干擾作用的濃度范圍[16]。而后通過干擾試驗(yàn)，對(duì)篩選出的無干擾質(zhì)量濃度進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)[17-18]。為了證實(shí)該濃度下，不同廠家的鱟試劑均能對(duì)本樣品進(jìn)行檢測(cè)，本試驗(yàn)采用兩個(gè)不同廠家的鱟試劑（λ=0.125 EU·mL-1）對(duì)3個(gè)批次的樣品進(jìn)行試驗(yàn)[19-20]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，磷酸左奧硝唑酯二鈉制備成供試品溶液并稀釋至6.25 mg·mL-1及以下濃度后，用靈敏度為0.125 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行檢查，無干擾作用。因此，磷酸左奧硝唑酯二鈉用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，方法可行。

 

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