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摘要：

目的：建立同時(shí)測(cè)定中藥口服液產(chǎn)品中苯甲酸、山梨酸、三氯卡班、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸異丙酯等23種防腐劑的的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。

方法：樣品以甲醇為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，離心后取上清液以Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）進(jìn)行分離，0.01 mol·L-1醋酸銨溶液和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫；流速為0.4 mL·min-1。結(jié)果：在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，23種防腐劑質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r≥0.99）；檢測(cè)下限在1~40 ng·mL-1間；平均回收率范圍為75.1%~115.0%，日內(nèi)精密度為0.92%~3.3%。

結(jié)論：該方法分析速度快，準(zhǔn)確度好，靈敏度高，可用于中藥口服液中防腐劑的快速篩查。

 

防腐劑具有防腐、抑菌殺菌、延長(zhǎng)保質(zhì)期的作用，中藥口服液中添加防腐劑是為了在生產(chǎn)、使用和保存過(guò)程中免受致病性和非致病性微生物污染。防腐劑種類繁多，中藥口服液中最常使用的防腐劑有山梨酸、苯甲醇、異噻唑啉酮類、尼鉑金類、苯扎氯銨類等。關(guān)于防腐劑的檢測(cè)研究主要集中在化妝品、食品和工業(yè)產(chǎn)品領(lǐng)域中，中藥口服液中防腐劑的研究報(bào)道較少[1-3]。目前，防腐劑的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[4]、毛細(xì)管電泳法[5]、液相色譜法[6]、離子色譜法[7]和氣相色譜-質(zhì)譜法[8]等，色譜法采用保留時(shí)間和光譜進(jìn)行定性，無(wú)法排除基質(zhì)干擾帶來(lái)的色譜峰分離不完全問(wèn)題，不可避免會(huì)出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性的情況。建立中藥口服液中防腐劑高通量篩查方法，可快速、準(zhǔn)確地反映產(chǎn)品中防腐劑的實(shí)際添加情況，為藥品監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

 

本研究以中藥口服液中常用防腐劑為研究對(duì)象，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)，建立同時(shí)檢測(cè)23種防腐劑的高通量篩查方法。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，可用于中藥口服液中防腐劑的快速篩查[9-11]。

 

1 儀器與試藥 

 

Agilent 1290 Infinity超高壓液相色譜儀（6490 Triple Quad LC/MS、ESI源），安捷倫公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Waters公司；Milli-Q超純水器，Millipore公司；Satorius CP225D十萬(wàn)分之一電子天平，賽多利斯公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

 

對(duì)照品：芐索氯銨（TRC公司，批號(hào)7-SXG-117-1，純度96%），十四烷基二甲基芐基氯化銨（Aladdin公司，批號(hào)H1330003，純度98.0%），十六烷基二甲基芐基氯化銨（Aladdin公司，批號(hào)K1504017，純度95%），氯咪巴唑（TCI公司提供，批號(hào)XQGKB，純度99.9%），碘丙炔醇丁基氨甲酸酯（源葉生物公司，批號(hào)MFCD00072438，純度98.0%），甲基異噻唑啉酮（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號(hào)G121713，純度97.0%），甲基氯異噻唑啉酮（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號(hào)125746，純度99.0%），2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇（曼哈格公司，批號(hào)160617，純度99.1%），鄰苯基苯酚（Dr.Ehrensorfer公司，批號(hào)F2225S，純度96.8%），4-羥基苯甲酸（上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號(hào)Q2080050，純度99.9%），4-羥基苯甲酸丙酯（Acros Organics公司，批號(hào)A0274298，純度99.5%），4-羥基苯甲酸異丙酯（TCI公司，批號(hào)NTQUC-WQ，純度99.8%），4-羥基苯甲酸異丁酯（TCI公司，批號(hào)AGN01-GUWT，純度99%），4-羥基苯甲酸丁酯（Acros Organics公司，批號(hào)A0270136，純度99.9%），4-羥基苯甲酸乙酯（曼哈格公司，批號(hào)160706，純度99.9%），4-羥基苯甲酸甲酯（Acros Organics公司，批號(hào)A0257407，純度99%），苯甲酸（Acros Organics公司，批號(hào)A0280404，純度99.6%），溴氯芬（曼哈格公司，批號(hào)185934，純度100%），氯二甲酚（曼哈格公司，批號(hào)170345，純度98.5%），芐氯酚（Aladdin公司，批號(hào)EK2308，純度97.5%），對(duì)氯間甲酚（曼哈格公司，批號(hào)1603652，純度98.0%），三氯卡班（Dr.Ehrensorfer公司，批號(hào)30729，純度99%），山梨酸（Accu Standard公司，批號(hào)22821，純度99%）。

 

甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨均為色譜純；空白基質(zhì)，市售口服液，經(jīng)檢測(cè)不含上述23種防腐劑。

 

2 方法[12-13] 

 

2.1 色譜條件 

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，十八烷基硅烷鍵合硅膠）；流動(dòng)相：溶液A為0.01mol·L-1醋酸銨-水溶液，溶液B為甲醇，梯度洗脫，程序見(jiàn)表 1、2；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

 

 

 

2.2 質(zhì)譜條件 

離子源：電噴霧離子源（ESI源）；霧化氣流速：172 kPa；干燥氣流速：14 L·min-1；碰撞氣（Ar）流速：230 kPa；鞘氣加熱溫度：200 ℃；氣體溫度：180 ℃；離子化電壓：3 000 V（負(fù)離子模式），3 500 V（正離子模式）；監(jiān)測(cè)模式：正、負(fù)離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其他相關(guān)參數(shù)信息見(jiàn)表 3。

 

 

2.3 對(duì)照品溶液的制備 

分別精密稱取23種防腐劑對(duì)照品20 mg（必要時(shí)需折算），精確到0.000 1 g，分別置20 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得各單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用0.2%甲酸-甲醇溶液稀釋并定容，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度見(jiàn)表 4。

 

 

2.4 供試品溶液的制備 

精確量取供試品1.0 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）提取15 min，取出，放冷至室溫后，用甲醇定容至刻度，搖勻，4 500 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

 

3 結(jié)果與討論 

3.1 線性范圍及檢測(cè)下限 

取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用0.2%甲酸-甲醇溶液稀釋得系列濃度對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，考察各成分定量離子峰面積對(duì)應(yīng)濃度的線性相關(guān)性。結(jié)果在本方法條件下，甲基異噻唑啉酮等23種組分的檢測(cè)響應(yīng)值與樣品中被測(cè)物質(zhì)濃度在相對(duì)應(yīng)的范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好（r≥0.99）；取空白基質(zhì)進(jìn)行低濃度水平的添加，測(cè)定信噪比，以信噪比為3:1計(jì)算檢測(cè)下限，結(jié)果23種防腐劑的檢測(cè)下限均 < 0.001%，詳見(jiàn)表 5。

 

 

3.2 回收率試驗(yàn)及精密度 

精確量取空白基質(zhì)18份，分別添加低、中、高3種不同濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按本法處理后測(cè)定，計(jì)算各防腐劑組份的平均回收率，結(jié)果不同濃度添加水平的回收率為75.1%~115.0%；日內(nèi)精密度為0.92%~3.3%，見(jiàn)表 6。

 

 

3.3 方法特異性 

取市售經(jīng)檢查不含上述23種防腐劑的口服液作為空白基質(zhì)，考察了口服液空白基質(zhì)和添加甲基異噻唑啉酮等23種組分后的色譜圖和質(zhì)譜圖。結(jié)果如圖 1~3所示，表明口服液基質(zhì)中存在的物質(zhì)對(duì)本方法目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)基本沒(méi)有干擾。

 

A.正離子模式（positive ion mode） B.負(fù)離子模式（negative ion mode）

圖 1 空白基質(zhì)定量離子對(duì)色譜圖

Fig.1 Quantitative ion pair chromatograms of blank matrix

 

1.對(duì)羥基苯甲酸（phydroxybenzoic acid） 2.苯甲酸（benzoic acid） 3. 2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇（2-bromo-2-nitropropane-1，3-diol） 4. 4-羥基苯甲酸甲酯（methyl 4-hydroxybenzoate） 5. 4-羥基苯甲酸乙酯（ethyl 4-hydroxybenzoate） 6.對(duì)氯間甲酚（p-chlorocresol） 7.鄰苯基苯酚（o-phenylphenol） 8.氯二甲酚（chloro two creso） 9. 4-羥基苯甲酸異丙酯（isopropyl 4-hydroxybenzoate） 10. 4-羥基苯甲酸丙酯（propyl 4-hydroxybenzoate） 11. 4-羥基苯甲酸異丁酯（isobutyl 4-hydroxybenzoate） 12. 4-羥基苯甲酸丁酯（butyl 4-hydroxybenzoate） 13.芐氯酚（benzyl chlorophenol） 14.三氯卡班（triclocarban） 15.溴氯芬（bromo chlorifen）

 

 

圖 2 空白基質(zhì)加標(biāo)定量離子對(duì)色譜圖（負(fù)離子模式）

Fig.2 Quantitative ion pair chromatograms of blank matrix added with standards(negative ion mode)

  

16.甲基異噻唑啉酮（methy lisothiazolinone） 17.甲基氯異噻唑啉酮（methyl chloroisothiazolone） 18.碘丙炔醇丁基氨甲酸酯（iodopropynol butyl carbamate） 19.山梨酸（sorbic acid） 20.氯米巴唑（climopazol） 21.芐索氯銨（benzethonium chloride） 22.十四烷基二甲基芐基氯化銨（tetradecyl dimethyl benzyl ammonium chloride） 23.十六烷基二甲基芐基氯化銨（cetalkonium chloride）

 

 

圖 3 空白基質(zhì)加標(biāo)定量離子對(duì)色譜圖（正離子模式）

Fig.3 Quantitative ion pair chromatogram of blank matrix added with standards(positive ion mode)

 

3.4 樣品測(cè)定 

對(duì)市售45批中藥口服液樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果60%的樣品中檢出防腐劑，其中10批檢出山梨酸，檢出量為0.003 0~0.50 g·L-1；14批檢出苯甲酸，檢出量為0.005 9~0.55 g·L-1；3批檢出4-羥基苯甲酸甲酯，檢出量為0.01~0.12 g·L-1。經(jīng)與標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)核對(duì)，12批檢出防腐劑的樣品未標(biāo)識(shí)添加上述防腐劑，防腐劑的實(shí)際檢出情況與標(biāo)簽標(biāo)識(shí)不一致比例高達(dá)44%。

 

4 結(jié)論 

本研究以中藥口服液中限用防腐劑名單為基礎(chǔ)，按防腐劑的特點(diǎn)進(jìn)行分類測(cè)定，一些沸點(diǎn)低易揮發(fā)的物質(zhì)并有文獻(xiàn)報(bào)道的如苯甲醇、苯氧乙醇、三氯叔丁醇、二氯苯甲醇?xì)w為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法范疇，其余23種采用液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定。通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜條件的摸索，初步確定該23種組分適用于高相液相-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)[14-15]。經(jīng)驗(yàn)證，建立的測(cè)定方法的線性關(guān)系良好，回收率在80%~110%之間，方法檢測(cè)下限能滿足使用要求。

 

該方法覆蓋了常用防腐劑品種，解決了目前中藥口服液中防腐劑檢驗(yàn)方法不完善、無(wú)質(zhì)譜驗(yàn)證方法的缺陷，可廣泛適用于防腐劑的快速篩查。

 

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