FDA 2018年5月的新版生物分析方法驗(yàn)證指南

（FDA 2018/05/21 現(xiàn)行定稿指南）

 

I. 介紹

本指導(dǎo)原則有助于研究用新藥申請（IND）或新藥申請（NDA）、仿制藥申請（ANDA）、生物制品許可（BLA）和補(bǔ)充申請的申請人在需要 藥代動力學(xué)、毒代動力學(xué)或生物標(biāo)志物濃度評估的人體臨床藥理學(xué)、生物利用度（BA）、生物等效性（BE）研究的生物分析方法驗(yàn)證。² 該指南還可以為需要毒代動力學(xué)或生物標(biāo)志物濃度數(shù)據(jù)的非臨床研究的生物分析方法的開發(fā)提供參考。對于獸藥批準(zhǔn)過程相關(guān)的研究，如研究用新動物藥申請（INADs），新動物藥申請（NADAs）和簡化新動物藥申請（ANADAs），本指南可適用于血液和尿液 BA、BE 和藥代動力學(xué)研究。

本指南中的信息適用于定量測定生物基質(zhì)（如全血、血清、血漿、尿、組織例如皮膚）中藥物、代謝物、治療用蛋白、和生物標(biāo)志物水平的生物分析方法，如色譜分析（CC）和配體結(jié)合分析（LBA）。

本定稿指南考慮了2013年指南草案收到的公眾意見，并為生物樣品分析方法的開發(fā)、驗(yàn)證和試驗(yàn)中的使用提供建議。根據(jù)生物分析方法的具體類型，如果有合理性依據(jù)，可以修改本指南的建議。本指南反映了生物分析方法驗(yàn)證方面的進(jìn)展。

通常，F(xiàn)DA指南文件不具有法律執(zhí)行責(zé)任。指南介紹了FDA對于某一話題的當(dāng)前看法，除非引用了特定的監(jiān)管或法律要求，指南應(yīng)僅被視作建議。“should”在FDA的指南文件中意為某事是建議或推薦做法，不是規(guī)定。

II. 背景

2001年“生物分析方法驗(yàn)證”行業(yè)指南最初是基于兩個(gè)研討會的考慮，這兩個(gè)研討會的題目是：

• 分析方法驗(yàn)證：生物利用度，生物等效性和藥代動力學(xué)研究³
• 生物分析方法驗(yàn)證：重新審視十年進(jìn)展⁴

以下額外的研討會，為后續(xù)修訂提供參考（例如，2013年的指南草案“生物分析方法驗(yàn)證”⁵):

• 定量生物分析方法驗(yàn)證和實(shí)施：色譜和配體結(jié)合分析的最佳實(shí)踐²
• 美國藥學(xué)科學(xué)家協(xié)會 / FDA“用于評價(jià)方法重現(xiàn)性的試驗(yàn)樣品再分析”的研討會⁷
• 美國藥學(xué)科學(xué)家協(xié)會（AAPS）舉辦的“定量生物分析方法驗(yàn)證和實(shí)施 – 2013年版FDA指南”研討會⁸

特定生物基質(zhì)（如血液，血漿，血清或尿液）中的分析物（即，藥物、包括生物制產(chǎn)品及其代謝物）和生物標(biāo)志物進(jìn)行定量評估的經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法，對于非臨床、生物藥劑學(xué)、和臨床藥理學(xué)研究的成功實(shí)施是至關(guān)重要的。這些經(jīng)過驗(yàn)證的方法提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)，以支持藥品和生物制品的安全性和有效性。分析方法的驗(yàn)證通過解決以下關(guān)鍵問題，可確保數(shù)據(jù)的可靠性，關(guān)鍵問題包括：

• 該方法是否可以檢測預(yù)期的分析物？例如，是否有物質(zhì)干擾檢測，分析方法是分析物特有的或選擇性的方法？
• 與檢測相關(guān)的變異性是多少？例如，該方法的準(zhǔn)確度和精密度？
• 提供可靠數(shù)據(jù)的檢測范圍是多少？例如，該方法的靈敏度是多少（例如，該方法的定量下限（LLOQ）、定量上限（ULOQ）是多少？）
• 樣品采集、處理和儲存如何影響生物分析方法數(shù)據(jù)的可靠性？例如，樣品收集時(shí)需要遵循哪些步驟？運(yùn)輸過程中是否需要冷凍樣品？需要什么樣的溫度來儲存樣品，樣品可以儲存多長時(shí)間？

對已驗(yàn)證的方法進(jìn)行更改時(shí)，申辦者應(yīng)進(jìn)行額外的驗(yàn)證（即，部分驗(yàn)證或交叉驗(yàn)證）。

符合目的（fit-for-purpose ，F(xiàn)FP）的概念指出，驗(yàn)證的水平應(yīng)適合研究的預(yù)期目的。上述列出的關(guān)鍵問題應(yīng)該相對于藥品開發(fā)階段進(jìn)行評估。在NDA、BLA或ANDA中的關(guān)鍵研究（如，BE或藥代動力學(xué)研究），需要做出批準(zhǔn)、安全性或標(biāo)簽的決定，應(yīng)該包括充分驗(yàn)證的生物分析方法。不用于支持監(jiān)管決定的探索性方法（如，候選人選擇）可能不需要這樣嚴(yán)格的驗(yàn)證。 該“符合目的”的概念適用于藥品、代謝物和生物標(biāo)志物。

進(jìn)行用于監(jiān)管提交的毒理學(xué)研究的分析實(shí)驗(yàn)室應(yīng)遵守21 CFR 58，良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（GLP）。⁹ 用于人體BA、BE和藥代動力學(xué)研究的生物分析方法必須符合 21 CFR 320 “生物等效性和生物可用性要求”（即，21 CFR 320.29）中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。

以下章節(jié)討論了生物分析方法的開發(fā)、驗(yàn)證和研究中的使用，以及如何最好地記錄驗(yàn)證方法和結(jié)果。本指南中使用的方法參數(shù)和分析術(shù)語的定義，請參見術(shù)語表。

III. 生物分析方法的開發(fā)和驗(yàn)證

A. 指導(dǎo)原則

生物分析方法開發(fā)的目的是確定方法的設(shè)計(jì)、操作條件、限制和適用性符合預(yù)期目標(biāo)，并確保方法經(jīng)過優(yōu)化。

在生物分析方法開發(fā)之前，申辦者應(yīng)該了解目標(biāo)分析物（例如，確定藥物的物理化學(xué)性質(zhì)，體外和體內(nèi)代謝，以及蛋白質(zhì)結(jié)合）并考慮可能適用的任何已有分析方法的方面。

方法開發(fā)和驗(yàn)證的要素和接受標(biāo)準(zhǔn)總結(jié)在表1中。表2描述了申辦者如何記錄生物分析方法的開發(fā)和驗(yàn)證，以及應(yīng)該存儲或提交的位置。

方法開發(fā)包括提取和檢測分析物有關(guān)的規(guī)程和條件的優(yōu)化。 方法開發(fā)包括以下生物分析參數(shù)的優(yōu)化（將在第III.B章節(jié)中詳細(xì)討論）以確保該方法適用于驗(yàn)證：

• 對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
• 關(guān)鍵試劑
• 校準(zhǔn)曲線
• 質(zhì)控樣品（質(zhì)控樣品s）
• 選擇性和特異性
• 靈敏度
• 準(zhǔn)確度
• 精密度
• 回收率
• 分析物在基質(zhì)中的穩(wěn)定性

生物分析方法開發(fā)不需要大量的記錄保存或注釋。但是，申辦者應(yīng)該在開發(fā)生物分析方法的過程中記錄規(guī)程的變更，以及任何問題及其解決方案，以便為方法開發(fā)過程中的任何變更提供依據(jù)。

生物分析方法驗(yàn)證表明，最優(yōu)化的方法適合試驗(yàn)樣品的分析。 申辦者應(yīng)該：

• 對任何新的生物分析方法進(jìn)行全面驗(yàn)證，以分析新藥物實(shí)體、代謝物或生物標(biāo)記物。
• 對增加代謝物或額外分析物的現(xiàn)有已驗(yàn)證方法的任何修訂，進(jìn)行全面驗(yàn)證。
• 在開始驗(yàn)證之前，為生物分析方法建立詳細(xì)的書面描述（例如，方案、研究計(jì)劃和/或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP））。描述應(yīng)該確定從采樣時(shí)間到分析時(shí)間，控制方法中的關(guān)鍵參數(shù)（例如，環(huán)境、基質(zhì)、規(guī)程變量）的規(guī)程，以盡量減少它們對基質(zhì)中分析物測量的影響。
• 記錄和報(bào)告（在方法驗(yàn)證報(bào)告中）用于聲明或得出“該方法有效性”結(jié)論的所有試驗(yàn)。
• 驗(yàn)證生物基質(zhì)中每種分析物的檢測結(jié)果。表1具體列出了每個(gè)生物分析參數(shù)的具體要求和接受標(biāo)準(zhǔn)。

B. 色譜分析（CC）和配體結(jié)合分析（LBA）的生物分析參數(shù)

下面討論適用于CC和LBA的生物分析參數(shù)。單獨(dú)針對CC或LBA的問題已具體指出。

1. 對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和關(guān)鍵試劑

申辦者應(yīng)對所有對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和關(guān)鍵試劑（如，抗體、標(biāo)記的分析物和基質(zhì)）進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶卣髅枋龊陀涗洠ㄈ纾_定鑒別、純度和穩(wěn)定性），并將其存儲在特定的條件下。

a. 對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

用于制備校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度會影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，申辦者應(yīng)使用具有已知鑒別和純度的已認(rèn)證對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來制備已知濃度的溶液。對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)與分析物相同；然而，當(dāng)這種情況不可行時(shí)，申辦者可以使用已知純度的已建立的化合物形式（例如，游離堿、游離酸或鹽）。

對市售可得的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，申辦者應(yīng)提供分析證書（CoA），包括來源、批號和有效期日期（美國藥典（USP）標(biāo)準(zhǔn)品例外）。對于沒有CoA的內(nèi)部或外部標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，除了來源和批號外，申辦者還應(yīng)提供標(biāo)準(zhǔn)品鑒別和純度的證據(jù)。使用超出有效期的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，申辦者應(yīng)提供最新的CoA或重新確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的鑒別和純度。如果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)超出有效期，申辦者不應(yīng)該使用這批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制儲備液，除非重新建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度。對于內(nèi)標(biāo)（IS），如果證明IS適用于特定用途（例如，對分析物沒有干擾），則申辦者不必提供CoA或純度證明。

b. 關(guān)鍵試劑

申辦者應(yīng)適當(dāng)?shù)乇碚骱陀涗涥P(guān)鍵試劑（即，確定其身份、純度和穩(wěn)定性），包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、抗體、標(biāo)記的分析物和基質(zhì)。

當(dāng)關(guān)鍵試劑發(fā)生變化時(shí)，分析驗(yàn)證非常重要，如批次間變化或換為其他試劑。例如，如果標(biāo)記的分析物、檢測試劑或抗體發(fā)生變化，申辦者應(yīng)該：

• 評估結(jié)合，并重新優(yōu)化方法
• 用標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品確認(rèn)性能
• 評估交叉反應(yīng)性

2. 校準(zhǔn)曲線

在方法開發(fā)過程中，申辦者應(yīng)根據(jù)特定試驗(yàn)中預(yù)期的濃度范圍選擇方法定量范圍和校正標(biāo)樣的濃度。對于LBA，除了校正標(biāo)樣外，定量范圍之外的錨定點(diǎn)可以幫助擬合曲線。不應(yīng)將錨定點(diǎn)用作運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)的一部分。對于大多數(shù)LBA，校準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)）曲線本質(zhì)上是非線性的，并且通常，LBA需要比CC更多的校正標(biāo)樣來定義校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的擬合。另外，LBA標(biāo)準(zhǔn)曲線的響應(yīng) – 誤差關(guān)系是平均響應(yīng)的變量函數(shù)（即，變異性heteroscadisticity）。

申辦者應(yīng)使用充分描述濃度 – 響應(yīng)關(guān)系的最簡單模型，以及適當(dāng)?shù)募訖?quán)方案和回歸方程。對于LBA，濃度 – 響應(yīng)關(guān)系通常適合采用四參數(shù)或五參數(shù)回歸模型，但也可以評估其他模型。

當(dāng)方法驗(yàn)證時(shí)，校準(zhǔn)曲線應(yīng)該是連續(xù)的和可重現(xiàn)的。申辦者應(yīng)該使用與預(yù)期試驗(yàn)樣品相同的生物基質(zhì)制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)樣品可能含有多個(gè)分析物。申辦者應(yīng)該為樣品中的每個(gè)分析物生成校準(zhǔn)曲線。當(dāng)需要替代基質(zhì)時(shí)，申辦者應(yīng)該證明和驗(yàn)證校準(zhǔn)曲線。

表1列出了校準(zhǔn)曲線的要求，包括LLOQ，ULOQ和接受標(biāo)準(zhǔn)。

3. 質(zhì)控樣品

質(zhì)控樣品用于評估方法的精確度和準(zhǔn)確度以及樣品的穩(wěn)定性。申辦者應(yīng)該使用與已驗(yàn)證的方法待分析的試驗(yàn)樣品相同的基質(zhì)來制備質(zhì)控樣品。在方法開發(fā)過程中，建議使用新制備的質(zhì)控樣品進(jìn)行精密度和準(zhǔn)確度分析，因?yàn)榇藭r(shí)通常尚未產(chǎn)生穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。

在方法驗(yàn)證期間，質(zhì)控樣品用于評估方法性能和分析物的穩(wěn)定性。在驗(yàn)證運(yùn)行中包括性能質(zhì)控樣品，以確定方法的精密度和準(zhǔn)確度（見第III.B章節(jié)）。穩(wěn)定性質(zhì)控樣品評估分析物在各種應(yīng)力條件下的穩(wěn)定性（關(guān)于質(zhì)控樣品濃度的選擇，請參見第III.B章節(jié)）。

質(zhì)控樣品的配制應(yīng)該與校正標(biāo)樣使用不同的儲備液。然而，如果申辦者可以證明使用由不同儲備液制備的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品、在一次驗(yàn)證運(yùn)行中的精密度和準(zhǔn)確度，那么申辦者可以在隨后的運(yùn)行中使用由該儲備液制備的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。申辦者應(yīng)該在沒有干擾或基質(zhì)效應(yīng)的大量空白基質(zhì)中制備校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。

4. 選擇性和特異性

在方法開發(fā)過程中，申辦者應(yīng)確認(rèn)被測物質(zhì)是目標(biāo)分析物，以盡量減少或避免干擾。該方法的選擇性通常通過分析多個(gè)來源的適當(dāng)生物基質(zhì)（例如，血漿）的空白樣品而被證明。根據(jù)方法的預(yù)期用途，可以在選擇性評估中包括溶血樣品、高血脂樣品或來自特定人群的樣品的影響。當(dāng)使用液相色譜/質(zhì)譜（LC / MS）方法時(shí)，申辦者或申請人應(yīng)確定基質(zhì)對離子抑制、離子增強(qiáng)或提取效率的效應(yīng)。應(yīng)該評估內(nèi)標(biāo)以避免干擾分析物。生物基質(zhì)中潛在的干擾物質(zhì)包括內(nèi)源性基質(zhì)成分，如代謝物，分解產(chǎn)物 - 以及實(shí)際試驗(yàn) – 同時(shí)服用藥物和其他外援物。如果在樣品采集期間使用穩(wěn)定劑或酶抑制劑，申辦者應(yīng)評估對分析物定量產(chǎn)生干擾的可能性。申辦者應(yīng)該對方法開發(fā)過程中評估這些（以及其他任何潛在干擾）的需求做出合理性依據(jù)。

在驗(yàn)證過程中，申辦者應(yīng)確認(rèn)該方法不含潛在的干擾物質(zhì)，包括內(nèi)源性基質(zhì)成分、代謝物、預(yù)期的同時(shí)服用藥物等。如果試驗(yàn)樣品含有多個(gè)分析物，并且分析物旨在通過不同的方法進(jìn)行定量，申辦者應(yīng)該檢測每種方法是否受到其他分析物的干擾。

申辦者應(yīng)分析至少6個(gè)（對于CC）或10個(gè)（對于LBA）個(gè)體來源的適當(dāng)生物基質(zhì)（例如，血漿）的空白樣品。申辦者應(yīng)確保在整個(gè)方法的應(yīng)用過程中不存在基質(zhì)效應(yīng)。關(guān)于選擇性和特異性要求和接受標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)節(jié)，請參見表1。

對于LBA，研究來源于結(jié)構(gòu)或生理學(xué)相似分析物（即，外源性干擾）或基質(zhì)效應(yīng)（即，內(nèi)源性干擾）的干擾是非常重要的。研究外源性干擾涉及確定可能干擾結(jié)合相互作用的分子的交叉反應(yīng)性，包括與藥物、任何代謝物、同時(shí)服用藥物（及其重要代謝物）或內(nèi)源性基質(zhì)組分結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子。申辦者應(yīng)單個(gè)評估每個(gè)因素，并結(jié)合目標(biāo)分析物來確定其引起干擾的能力。基質(zhì)效應(yīng)評估涉及將多個(gè)來源的生物基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與平行基質(zhì)（用于評價(jià)方法重現(xiàn)性的連續(xù)稀釋）和非特異性結(jié)合基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。申辦者應(yīng)該消除或減少任何重大干擾。如果這種嘗試不成功，申辦者可以考慮開發(fā)正交方法以消除或最小化干擾。

在分析方法中可能發(fā)生樣品之間的殘留。申辦者應(yīng)在方法開發(fā)過程中消除任何殘留。如果無法消除殘留，申辦者應(yīng)評估方法驗(yàn)證期間的殘留對試驗(yàn)樣品濃度準(zhǔn)確度的影響。

5. 靈敏度

定量下限 （LLOQ）確定了方法靈敏度，應(yīng)在方法開發(fā)過程中確定。應(yīng)開發(fā)和驗(yàn)證該方法，使其能夠滿足預(yù)期研究樣品所需的要求。LLOQ評估可以單獨(dú)完成，也可以作為校準(zhǔn)范圍精密度和準(zhǔn)確度評估的一部分。表1列出了驗(yàn)證靈敏度的具體要求。

6. 準(zhǔn)確度，精密度和回收率

在方法開發(fā)過程中評估定量范圍內(nèi)的準(zhǔn)確度和精確度對于確定該方法是否可以進(jìn)行驗(yàn)證并涉及分析在整個(gè)檢測范圍內(nèi)多個(gè)濃度的重復(fù)質(zhì)控樣品是至關(guān)重要的。具體而言，申辦者應(yīng)評估在定量下限、低、中、高質(zhì)控樣品（以及LBA方法的定量上線）的性能，以確定該方法是否適合分析研究樣品。

用于估算準(zhǔn)確度和精密度的方法驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)包括在多天內(nèi)進(jìn)行的最少三次（對于CC）和六次（對于LBA）的獨(dú)立運(yùn)行（即，精密度和精確度（A＆P）運(yùn)行；參見表1）。每次A＆P運(yùn)行應(yīng)包括1條標(biāo)準(zhǔn)曲線和重復(fù)分析的多個(gè)質(zhì)控樣品濃度。申辦者應(yīng)該根據(jù)A＆P運(yùn)行中質(zhì)控樣品的性能確定方法的準(zhǔn)確度和精確度。表1列出了準(zhǔn)確度和精密度以及A＆P運(yùn)行的具體驗(yàn)證要求。申辦者應(yīng)在所有A＆P運(yùn)行中使用新制備的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。在所有A＆P運(yùn)行中最好使用新鮮制備的質(zhì)控樣品；然而，如果這不可能，申辦者應(yīng)該在一次或多次A＆P運(yùn)行中使用新制備的質(zhì)控樣品。

申辦者應(yīng)優(yōu)化分析物的回收率以確保提取效率和重現(xiàn)性。回收率不一定是100％，但是分析物和內(nèi)標(biāo)回收的程度應(yīng)該是一致的和可重現(xiàn)的。申辦者應(yīng)通過比較提取樣品的分析結(jié)果和空白中加入提取后分析物的相應(yīng)提取物（即，代表100％的回收率），進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。

回收率評估對于LBA不是必需的，除非涉及樣品提取。回收率試驗(yàn)應(yīng)按照表1中的描述進(jìn)行。

7. 穩(wěn)定性

在方法開發(fā)過程中，申辦者應(yīng)確定給定基質(zhì)中分析物的化學(xué)穩(wěn)定性，包括樣品收集、處理和分析物儲存的影響。申辦者應(yīng)評估自動取樣器、實(shí)驗(yàn)臺、處理或提取過的樣品、凍融，儲備液和分析物的長期穩(wěn)定性。申辦者應(yīng)評估與試驗(yàn)樣品相同基質(zhì)的穩(wěn)定性; 然而，當(dāng)基質(zhì)很稀少時(shí)，申辦者可以探索使用合適的替代基質(zhì)。

對于復(fù)方給藥，或特定藥物方案的藥物，應(yīng)在其他藥物的存在下評估分析物的穩(wěn)定性。申辦者還應(yīng)該考慮在研發(fā)的藥物適應(yīng)癥下，通常已知患者同時(shí)服用藥物的情況下分析物的穩(wěn)定性。

根據(jù)分析物以及采樣和分析條件，在方法開發(fā)過程中評估分析物在全血中的穩(wěn)定性可能是有用的。例如，藥物可能在全血中不穩(wěn)定或在采樣期間吸附到細(xì)胞組分。

在驗(yàn)證過程中，穩(wěn)定性評估應(yīng)涵蓋在分析場地接收之前的預(yù)期樣品條件（例如，在臨床場地、運(yùn)輸過程中和所有其他二級場地）以及在分析站點(diǎn)接收和分析期間的收據(jù)。生物液體中藥物穩(wěn)定性的驗(yàn)證是儲存條件、藥物的物理化學(xué)性質(zhì)、基質(zhì)和容器系統(tǒng)的作用。分析物在特定基質(zhì)和容器系統(tǒng)中的穩(wěn)定性僅與該基質(zhì)和容器系統(tǒng)有關(guān)，不應(yīng)外推至其他基質(zhì)和容器系統(tǒng)。

如果儲存條件改變或在經(jīng)驗(yàn)證的儲存條件之外進(jìn)行樣品分析，則應(yīng)在新條件下重新建立穩(wěn)定性。如有必要，應(yīng)對全血中分析物的穩(wěn)定性進(jìn)行重新驗(yàn)證（例如，如果分析物在采血過程中不穩(wěn)定）。表1列出了穩(wěn)定性的具體要求和接受標(biāo)準(zhǔn)。

與基質(zhì)相關(guān)的穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)將穩(wěn)定性質(zhì)控樣品與新制備的質(zhì)控樣品新做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。盡管最好使用新制備的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品，但在某些情況下（例如，對于大分子），可能需要過夜冷凍。在這種情況下，申辦者應(yīng)提供合理性依據(jù)并證明凍融穩(wěn)定性。

所有穩(wěn)定性檢測（參見下面的列表）應(yīng)該使用在適當(dāng)?shù)臒o分析物、無干擾的生物基質(zhì)中、由新鮮分析物儲備液制備的分析物制備的一組樣品。

• 自動取樣穩(wěn)定性：只有當(dāng)自動進(jìn)樣器儲存條件不同或未被提取（或經(jīng)過處理的樣品）的穩(wěn)定性覆蓋時(shí)，申辦者才應(yīng)證明提取物在自動進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性。
• 實(shí)驗(yàn)臺穩(wěn)定性：申辦者應(yīng)確定樣品在試驗(yàn)樣品預(yù)期實(shí)驗(yàn)室處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性（例如，樣品保存在室溫下或在冰桶中的穩(wěn)定性）。
• 提?。ɑ蚪?jīng)過處理的樣品）的穩(wěn)定性：申辦者應(yīng)評估經(jīng)過處理的樣品穩(wěn)定性，包括與新鮮制備的校正標(biāo)樣相比，在自動取樣器中的停留時(shí)間。
• 凍融穩(wěn)定性：申辦者應(yīng)在最少三次凍融循環(huán)后評估樣品的穩(wěn)定性。質(zhì)控樣品應(yīng)按照與試驗(yàn)樣品相同的規(guī)程融化和分析。質(zhì)控樣品在兩個(gè)循環(huán)之間應(yīng)冷凍至少12小時(shí)。應(yīng)將凍融穩(wěn)定性質(zhì)控樣品與新鮮制備的校準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品進(jìn)行比較。
• 長期穩(wěn)定性：申辦者應(yīng)確定樣品在一段時(shí)間內(nèi)的長期穩(wěn)定性，該時(shí)間段等于或超過首次采樣和最后一次樣品分析的日期。試驗(yàn)用儲存溫度應(yīng)與用于儲存試驗(yàn)樣品的溫度相同。長期穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)與新制備的校準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品進(jìn)行比較。在零下20ºC時(shí)測定穩(wěn)定性可以覆蓋較低溫度下的穩(wěn)定性。
• 儲備液穩(wěn)定性：不應(yīng)采用即將到期的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成儲備液，除非儲備液中分析物的純度被重新確定。當(dāng)儲備溶液以不同的狀態(tài)（例如，溶液對固體）存在，或與認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有不同的緩沖液組合（對于大分子通常是這種情況），申辦者應(yīng)該有儲備液的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，以證明儲備液儲存穩(wěn)定性。

8. 稀釋效應(yīng)

如果該方法用于檢測稀釋的樣品，應(yīng)在驗(yàn)證期間監(jiān)測稀釋可靠性 通過用類基質(zhì)（like matrix）稀釋定量上限（ULOQ）以上的質(zhì)控樣品以使其在定量范圍內(nèi)，并且應(yīng)證明這些稀釋的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精確度。在驗(yàn)證過程中使用的稀釋應(yīng)該模擬試驗(yàn)中預(yù)期的稀釋。應(yīng)該在LBA中證明前帶效應(yīng)。參見表1的具體要求和接受標(biāo)準(zhǔn)。

9. 部分和交叉驗(yàn)證

以下部分確定了其他類型的方法驗(yàn)證。

a. 部分驗(yàn)證

部分驗(yàn)證用于評估已驗(yàn)證的生物分析方法的修改。部分驗(yàn)證的范圍可以從一個(gè)批內(nèi)（intra-assay）準(zhǔn)確度和精密度測定到幾乎完整驗(yàn)證。根據(jù)要求，部分驗(yàn)證的原始數(shù)據(jù)應(yīng)保存在分析場地以供檢查。屬于該類別的典型生物分析方法修改或變化包括但不限于以下內(nèi)容：

• 生物分析方法在實(shí)驗(yàn)室之間轉(zhuǎn)移
• 分析方法學(xué)的變化（例如，檢測系統(tǒng)的變化）
• 樣品處理規(guī)程的變化
• 樣品量的變化（例如，兒科樣品的小體積）
• 儀器和/或軟件平臺的變化
• 分析范圍的擴(kuò)展
• 在收集生物液體時(shí)抗凝劑的變化（例如，肝素轉(zhuǎn)為EDTA，但是平衡離子不變）
• 物種內(nèi)基質(zhì)的變化（例如，從人體血漿轉(zhuǎn)換為人體血液）或基質(zhì)內(nèi)物種的變化（例如，從大鼠血漿轉(zhuǎn)換為小鼠血漿）
• 對基質(zhì)的改變（例如，腦脊液）
• 證明分析物在同時(shí)服用藥物存在下的選擇性
• LBA關(guān)鍵試劑的變化（例如，批次間變化、試劑變化）

b. 交叉驗(yàn)證

交叉驗(yàn)證是對兩種或多種生物分析方法或技術(shù)的驗(yàn)證參數(shù)進(jìn)行比較，用于在同一試驗(yàn)或不同試驗(yàn)中生成數(shù)據(jù)。

此外，在單個(gè)試驗(yàn)中的樣品分析在多個(gè)場地或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行時(shí)，交叉驗(yàn)證是必要的。在這種情況下，應(yīng)采用共同基質(zhì)的質(zhì)控樣品和未混合的受試者樣品在每個(gè)場地或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行交叉驗(yàn)證，以確定實(shí)驗(yàn)室間的可靠性。當(dāng)體積不足時(shí)，可以使用混合樣品。在SOP或驗(yàn)證計(jì)劃應(yīng)該預(yù)先確定標(biāo)準(zhǔn)。

C. 驗(yàn)證方法：試驗(yàn)分析和報(bào)告的預(yù)期

本節(jié)介紹了使用已驗(yàn)證的生物分析方法進(jìn)行常規(guī)藥物分析的預(yù)期。表1列出了具體要求和接受標(biāo)準(zhǔn)。

• 如果評估系統(tǒng)適用性，應(yīng)使用特定的SOP。應(yīng)使用獨(dú)立于當(dāng)前試驗(yàn)校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和試驗(yàn)樣品的樣品確定系統(tǒng)適用性，包括儀器條件和儀器性能。應(yīng)保持系統(tǒng)適用性記錄，以供審計(jì)。

• 在所有分析運(yùn)行中應(yīng)包含標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品（詳見表1）。質(zhì)控樣品應(yīng)涵蓋預(yù)期試驗(yàn)樣品濃度范圍。

• 通常，在驗(yàn)證過程中確定的曲線擬合、加權(quán)和擬合優(yōu)度應(yīng)該在試驗(yàn)中的校準(zhǔn)曲線使用。驗(yàn)證和試驗(yàn)樣品分析之間的響應(yīng)- 函數(shù)關(guān)系的變化表示潛在的問題。應(yīng)該預(yù)先制定SOP以解決這些問題。

• 總的質(zhì)控樣品應(yīng)至少占總樣品數(shù)量的5％，或至少6個(gè)（低、中、高質(zhì)控樣品，兩份重復(fù)），以較高數(shù)量為準(zhǔn)（參見表1）。應(yīng)該在一次運(yùn)行的所有不同分析批中中使用重復(fù)的低、中、高質(zhì)控樣品。

• 如果試驗(yàn)樣品濃度聚集在標(biāo)準(zhǔn)曲線的較窄范圍內(nèi)，則應(yīng)增加額外的質(zhì)控樣品以覆蓋樣品范圍。如果在試驗(yàn)之前，額外的質(zhì)控樣品濃度沒有包括在已驗(yàn)證的質(zhì)控樣品范圍內(nèi)，則應(yīng)在繼續(xù)分析之前證明額外質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精確度。如果部分驗(yàn)證是可接受的，那么已分析過的樣品不需要重新分析。

• 在處理和分析過程中，質(zhì)控樣品應(yīng)該與試驗(yàn)樣品分開進(jìn)行。

• 在每次分析過程中，應(yīng)確認(rèn)在定量下限（LLOQ）沒有分析物干擾（參見表1選擇性和靈敏度）。

• 如果不符合校準(zhǔn)和/或質(zhì)控樣品接受標(biāo)準(zhǔn)，則分析運(yùn)行失敗（參見表1）。

• 在試驗(yàn)樣品分析過程中，應(yīng)將包含符合接受標(biāo)準(zhǔn)的分析運(yùn)行的質(zhì)控樣品結(jié)果（包括異常值）納入準(zhǔn)確度和精密度的評估中。應(yīng)報(bào)告所有分析運(yùn)行的質(zhì)控樣品結(jié)果（合格和不合格），但不合格運(yùn)行的質(zhì)控樣品結(jié)果不需要作為準(zhǔn)確度和精密度估算的一部分。

• 如果生物分析方法需要將整個(gè)分析運(yùn)行分為不同的分析批（例如，在明顯不同的時(shí)間、不同的分析員處理的樣品組），則每個(gè)不同批次應(yīng)處理所有水平的重復(fù)質(zhì)控樣品（例如低、中、高）以及試驗(yàn)樣品。例如，當(dāng)樣品數(shù)量超過96孔板的容量或固相提取歧管不能容納所有樣品時(shí)。請參見表1了解基于質(zhì)控樣品接受標(biāo)準(zhǔn)的可接受運(yùn)行。在不符合質(zhì)控樣品接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析運(yùn)行中的不同批次或批次可能會被拒絕，但是剩余批次可能合格，因?yàn)榉治鲞\(yùn)行符合整體質(zhì)控樣品的接受標(biāo)準(zhǔn)。

• 試驗(yàn)定量下限（LLOQ）以下所列濃度的試驗(yàn)樣品應(yīng)報(bào)告為低于LLOQ（BQL）。試驗(yàn)濃度高于定量上限（ULOQ）的樣品應(yīng)稀釋并重新分析，或應(yīng)擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)曲線并重新驗(yàn)證。

• 試驗(yàn)樣品稀釋液應(yīng)使用相同的基質(zhì)（例如，人體血漿至人體血漿）。

• 生物基質(zhì)中一個(gè)分析物在所有試驗(yàn)樣品的檢測應(yīng)在穩(wěn)定性數(shù)據(jù)涵蓋的時(shí)間段內(nèi)完成。如果樣品處理?xiàng)l件發(fā)生變化或超過有效的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，則應(yīng)在新條件下確定樣品的穩(wěn)定性。

• 對于CC，應(yīng)該監(jiān)測內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的變異性。SOP應(yīng)該預(yù)先行設(shè)定，以解決內(nèi)標(biāo)變異性的問題。

• 應(yīng)該監(jiān)測漂移，并且如果它對未知樣品濃度評估準(zhǔn)確度有影響的話（例如漂移對散布的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確性的影響），應(yīng)該解決。

• 所有來自一個(gè)受試者的試驗(yàn)樣品應(yīng)該在一次運(yùn)行中分析，特別是針對個(gè)別受試者重復(fù)檢測的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（例如，BE試驗(yàn)所需的交叉或順序設(shè)計(jì)）。如果采取其他方法，申辦者或申請人應(yīng)該證明該方法合理，并采取措施減少州期間的變異性。

• 應(yīng)該監(jiān)測殘留，如果有的話，應(yīng)解決其對試驗(yàn)樣品定量分析的影響。

• 應(yīng)進(jìn)行用于評價(jià)方法重現(xiàn)性的試驗(yàn)樣品再分析（ISR）（見第IV節(jié)表1和表2）。

• 應(yīng)預(yù)先確定描述重新分析原因的SOP或指南。重新分析僅適用于系統(tǒng)原因（例如，樣品高于定量上限ULOQ、樣品處理錯(cuò)誤、設(shè)備故障、色譜分析不良）。SOP應(yīng)包括重新分析的接受標(biāo)準(zhǔn)，申辦者或申請人應(yīng)報(bào)告最終值。具體要求如表1和表2所述。重新分析和報(bào)告的基本原理、方法和所有數(shù)據(jù)應(yīng)清楚記錄。

• 對于涉及多個(gè)分析物的試驗(yàn)樣品，不能因?yàn)橐粋€(gè)分析物不符合接受標(biāo)準(zhǔn)而拒絕另一個(gè)分析物的有效結(jié)果。

• 如果在人體試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)獨(dú)特或不成比例的高濃度代謝物，則可能需要根據(jù)活性、針對代謝物開發(fā)完整驗(yàn)證的檢測方法，（參見FDA行業(yè)指南“藥物代謝物安全性檢測” ¹⁰ )。

• 應(yīng)預(yù)先建立CC樣品數(shù)據(jù)重新積分的SOP或指南。本SOP或指南應(yīng)確定重新積分的標(biāo)準(zhǔn)以及重新積分如何進(jìn)行的方式。重新積分的理由應(yīng)該清楚地描述和記錄。應(yīng)該保持審計(jì)追蹤。原始和重新積分的數(shù)據(jù)應(yīng)該記錄并報(bào)告。