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摘要

 

高效液相色譜是有機(jī)分析，特別是藥物分析的重要手段。而色譜峰峰形影響著化合物的定量和定性。在影響色譜峰峰形的諸多因素中，“溶劑效應(yīng)”經(jīng)常被忽視。本文是對(duì)高效液相色譜中“溶劑效應(yīng)”的漫談，水平有限，歡迎批評(píng)指正。

 

高效液相色譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于有機(jī)分析，特別是藥物分析工作中。分析工作者通常將更多精力集中在流動(dòng)相和儀器方法的選擇上，忽視了溶解樣品所用溶劑的重要性。高效液相色譜進(jìn)樣之前，必須選擇一種合適的溶劑溶解樣品。如果溶劑選擇不當(dāng)則會(huì)產(chǎn)生“溶劑效應(yīng)”，使分析工作者在定性和定量分析中產(chǎn)生誤判，影響分析結(jié)果。因此，了解“溶劑效應(yīng)”產(chǎn)生的原因及掌握避免“溶劑效應(yīng)”的基本方法對(duì)分析工作者是十分必要的。

 

溶劑效應(yīng)的概念

 

溶劑效應(yīng)亦稱“溶劑化作用”。指液相反應(yīng)中，溶劑的物理和化學(xué)性質(zhì)影響反應(yīng)平衡和反應(yīng)速度的效應(yīng)?？赡茉斐缮V峰展寬、分叉、保留時(shí)間漂移、峰面積變化，雙峰等現(xiàn)象。與此同時(shí)，較早洗脫的峰出現(xiàn)前沿或分叉，較晚洗脫的峰峰形正?！?】。

 

 

溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的原因

 

樣品進(jìn)入高效液相色譜中，當(dāng)溶劑與流動(dòng)相存在差異時(shí)，一部分樣品溶解進(jìn)入了流動(dòng)相，一部分還留在溶劑里,造成色譜保留的差異。造成這種差異的原因主要有以下幾個(gè)方面：

 

（1）溶劑強(qiáng)度

 

在反相色譜系統(tǒng)中溶劑強(qiáng)度的順序?yàn)樗ㄗ钊酰技状迹家译妫家掖迹妓臍溥秽急迹级燃淄椋ㄗ顝?qiáng)）。溶解樣品的溶劑強(qiáng)度大于該樣品出峰時(shí)流動(dòng)相強(qiáng)度，樣品溶劑可以看成流動(dòng)相的一部分，一部分樣品溶解于溶劑中會(huì)被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動(dòng)相，被流動(dòng)相洗脫出，這樣會(huì)造成色譜峰的展寬或者分叉^【2】。圖1是溶劑強(qiáng)度對(duì)色譜峰形的影響。

 

圖1  溶劑強(qiáng)度對(duì)色譜峰影響^[2]

 

圖2是筆者采用AgilentZORBAX TC-C18色譜柱以乙腈-水（30:70）為流動(dòng)相，采用不同的溶劑對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行處理制備同一濃度的溶液，考察目標(biāo)分析物的峰面積及峰高。

 

圖2 不同溶劑溶劑效應(yīng)對(duì)比

 

（2）進(jìn)樣體積

 

進(jìn)樣體積造成的溶劑效應(yīng)是一般與溶劑種類有關(guān)的。流動(dòng)相作為溶劑時(shí)，增加進(jìn)樣體積后，目標(biāo)分析物色譜峰不會(huì)發(fā)生遷移，保留時(shí)間基本穩(wěn)定。使用強(qiáng)度大于該樣品出峰時(shí)流動(dòng)相強(qiáng)度的溶劑，增加進(jìn)樣體積后，目標(biāo)分析物色譜峰會(huì)向前遷移，直至裂分，并且峰高變小峰寬變大。這是因?yàn)檫M(jìn)樣體積較小時(shí)，擴(kuò)散至流動(dòng)相的目標(biāo)分析物占絕大多數(shù)，除了保留時(shí)間略微提前，峰形以及峰寬與流動(dòng)相溶解時(shí)基本一致。體積增大到一定程度，擴(kuò)散至流動(dòng)相氛圍的目標(biāo)物與留在溶劑氛圍的目標(biāo)物在數(shù)量上相當(dāng)時(shí)，色譜峰分叉明顯。當(dāng)樣品體積進(jìn)一步增大，絕大多數(shù)目標(biāo)物進(jìn)入色譜柱時(shí)是溶解在溶劑中的，目標(biāo)分析物的色譜峰已經(jīng)明顯向前遷移了。

 

常規(guī)情況下，為了獲得良好的峰形，推薦的進(jìn)樣量為10μL。不過(guò)實(shí)際情況中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)20μL、30μL、50μL甚至100μL的進(jìn)樣量，比如痕量物質(zhì)的定量。所以如果不能減少至合適的進(jìn)樣體積，為了獲得良好的響應(yīng)和峰形，應(yīng)盡量選擇與流動(dòng)相比例相同或相近的溶劑。

 

圖3是某講義引入的進(jìn)樣體積對(duì)峰形的影響。

 

 

（3）溶劑與流動(dòng)相的兼容性

 

有些樣品采用流動(dòng)相或者流動(dòng)相中的有機(jī)相溶解難度較大，分析工作者會(huì)采用氯仿、乙酸乙酯、苯等溶劑，這些溶劑與流動(dòng)相兼容性不佳，直接包裹溶質(zhì)跳過(guò)色譜初期的保留過(guò)程，待溶劑的分配平衡建立起來(lái)后溶質(zhì)過(guò)于展寬，甚至直接部分沖出色譜柱。^【3】其實(shí)在色譜柱中的流動(dòng)相只有50%是動(dòng)態(tài)，其余50%在死體積、載體間隙處于靜止?fàn)顟B(tài)。溶質(zhì)被固定相吸附先通過(guò)50%的“靜止區(qū)”，若溶劑及流動(dòng)相不兼容，則影響溶質(zhì)在溶劑與流動(dòng)相之間的傳遞，從而影響被固定相吸附而導(dǎo)致峰形變差。

 

圖4是色譜保留機(jī)理圖^[5]

 

（4）溶劑pH值

 

 

易于解離的化合物對(duì)流動(dòng)相的pH值較敏感。該化合物處理解離狀態(tài)下極性發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致固液分配系數(shù)發(fā)生較大變化。該影響經(jīng)常表現(xiàn)為保留時(shí)間的漂移而不是多個(gè)峰或者峰分叉等峰形差現(xiàn)象。

 

導(dǎo)致溶劑效應(yīng)除了上述原因一般還有溶劑紫外吸收、柱前管路、柱長(zhǎng)、離子締合、互變平衡等。再此就不做詳細(xì)敘述。

 

溶劑效應(yīng)的判斷方法

 

當(dāng)出現(xiàn)色譜峰異常時(shí)，比如色譜峰分叉，可采用全波長(zhǎng)掃描查看分叉色譜峰紫外吸收情況來(lái)進(jìn)行判斷。另外對(duì)樣品溶液進(jìn)行低樣本量（如0.5μL），若峰形正態(tài)基本就可以斷定為“溶劑效應(yīng)”。

 

溶劑效應(yīng)的消除方法

 

• 應(yīng)該盡量使用流動(dòng)相作為溶劑（梯度采用初始比例），可以極大減弱或消除溶劑對(duì)色譜行為的影響。溶劑中的有機(jī)相比例略低于流動(dòng)相有機(jī)相比例時(shí)峰形更好。

• 當(dāng)樣品濃度響應(yīng)較大，可以采用減少進(jìn)樣體積減弱溶劑的影響。但要酌情而定，比如在有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)，減少進(jìn)樣量常常會(huì)犧牲靈敏度。

• 當(dāng)溶劑因標(biāo)準(zhǔn)或者待測(cè)成分性質(zhì)不能改變時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相比例，使其強(qiáng)度盡量與溶劑接近，從而消除影響。

• 對(duì)于梯度洗脫而言，在不影響分離度的情況下，可以改用較粗內(nèi)徑的柱前管路。

• 適當(dāng)?shù)膶?duì)溶劑進(jìn)行轉(zhuǎn)換（酸提、堿提、回流酯化或開環(huán)、衍生化等）。

• 適當(dāng)?shù)膶?duì)溶劑進(jìn)行凈化（固相萃取、固相分離萃取、液液萃取、GPC凈化等）

• 吸樣后，針不回針座，懸停空中，計(jì)量泵吸-排-吸-排數(shù)次，使目標(biāo)物完全擴(kuò)散至流動(dòng)相。此條是同行相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，并未經(jīng)筆者驗(yàn)證。

 

溶劑要求

 

• 高純度：不能與固定相發(fā)生反應(yīng)，溶劑不純會(huì)引起基線變差，產(chǎn)生“偽峰”。

• 溶劑應(yīng)該與檢測(cè)器匹配，溶劑在紫外光條件下應(yīng)沒(méi)有吸收或吸收很小。

• 溶劑對(duì)于待測(cè)樣品具備足夠的溶解能力。溶劑的極性要與待測(cè)樣品相匹配，如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響純化分離，且會(huì)使柱子惡化。

• 溶劑化學(xué)穩(wěn)定性良好，不與樣品發(fā)生聚合反應(yīng)。

• 低粘度，沸點(diǎn)適中，減小溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力，降低柱壓，利于提高柱效^【4】。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等；粘度過(guò)低的溶劑也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。 

 

結(jié)語(yǔ)

 

以上是根據(jù)個(gè)人研究經(jīng)驗(yàn)結(jié)合相關(guān)資料總結(jié)的高效液相色譜使用中“溶劑效應(yīng)”相關(guān)觀點(diǎn)，由于閱歷較淺，未盡全面。不足之處還請(qǐng)諒解！

 

參考文獻(xiàn)

【1】 Lee H K , Hoffman N E . INJECTION SOLVENT EFFECT ON PEAK HEIGHT IN ION-EXCHANGE HPLC[J]. Journal of Chromatographic Science, 1992,30(10):415-421.

【2】Hoffman N E , Chang J H Y . Injection Solvent Enhancement of Peak Height in Reversed-Phase Liquid Chromatography[J]. Journalof Liquid Chromatography, 1991, 14(4):651-658.

【3】謝孟峽, 楊力力.酚類化合物的反相高效液相色譜研究（I）[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,1991(2):211-216.

【4】Castells C B , Castells R C . Peak distortion inreversed-phase liquid chromatography as a consequence of viscosity differences between sample solvent and mobile phase[J]. Journal of Chromatography A, 1998,805(1–2):55-61.

【5】溶劑對(duì)反相液相色譜中峰形的影響憶峰