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作者：王麗嬋 , 晁哲 , 吳燕 , 駱鵬 , 衛(wèi)辰 , 馬霄       

 

中國(guó)食品藥品檢定研究院, 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102629 

 

摘要：

目的：比較不同類型無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答及其持久性。

方法：將來(lái)自于3家企業(yè)，采用2種不同工藝生產(chǎn)的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗（組分苗和共純化苗）按一定比例稀釋后分別給3組小鼠皮下接種，0.5 mL/只，于第4周加強(qiáng)免疫，劑量與初免疫相同。于免疫后第4周、第5周、第8周、第12周、第17周、第30周、第40周、第50周和第65周取血，分離血清，檢測(cè)小鼠血清中抗百日咳抗體IgG水平（抗-PT和抗-FHA）和PT的中和抗體水平，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果：兩類疫苗組檢測(cè)結(jié)果比較，在免疫后第30周之前，兩組之間抗-PT和抗-FHA水平無(wú)顯著性差異；但在30周之后，兩組之間抗-PT和抗-FHA水平有顯著性差異（P < 0.05），組分苗組抗體水平高于共純化苗組。中和抗體方面，組分苗組中和抗體水平高于共純化苗組，兩組比較有顯著性差異（P < 0.05）。

結(jié)論：兩種類型的百日咳疫苗免疫小鼠后均能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，組分苗組的抗體持久性（包括百日咳抗體IgG和百日咳PT中和抗體）強(qiáng)于共純化苗組；且百日咳IgG抗體與中和抗體之間具有一定的相關(guān)性。

 

關(guān)鍵詞：無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗    抗體    中和抗體    免疫持久性

 

百日咳疫苗包括全細(xì)胞百日咳疫苗（Whole Cell Pertussis Vaccine，WPV）和無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗（Acellular Pertussis Vaccine，APV）兩種，其中，無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗根據(jù)百日咳工藝的不同又分為共純化無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗和組分無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。共純化無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗(以下簡(jiǎn)稱共純苗)采用共純化技術(shù)自發(fā)酵產(chǎn)物中提取百日咳抗原，主要抗原成分為百日咳毒素（Pertussis Toxin，PT）和絲狀血凝素（Filamentous Haemagglutinin，F(xiàn)HA）。組分無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗（以下簡(jiǎn)稱組分苗），采用的是柱層析分別純化工藝自發(fā)酵產(chǎn)物中提取有效抗原，主要抗原包括PT、FHA和百日咳粘著素（Pertactin，PRN）三種成分，有效抗原成分明確且精確定量，質(zhì)量穩(wěn)定可控。目前，通過(guò)分別純化工藝生產(chǎn)的已經(jīng)上市的組分百日咳疫苗主要來(lái)自于進(jìn)口，國(guó)內(nèi)組分百日咳疫苗尚處于新藥注冊(cè)階段。目前，國(guó)內(nèi)大部分人群使用的是我國(guó)自主生產(chǎn)的共純化無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。

 

百日咳血清學(xué)效力檢測(cè)方法（Pertussis Serological Potency Test，PSPT），即百日咳疫苗免疫小鼠后，檢測(cè)其百日咳特異性抗體IgG水平作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，此方法主要評(píng)價(jià)的是體液免疫效果。百日咳毒素CHO中和抗體法，主要檢測(cè)的是疫苗主要成分PT免疫后產(chǎn)生的功能性抗體，與PSPT法檢測(cè)的PT結(jié)合抗體不同，可以更確切地反映疫苗保護(hù)效果。意大利Von Hunolstein和美國(guó)Sutherland等人均認(rèn)為此方法可輔助PSPT的檢測(cè)[1-3]。本文主要觀察這兩類百日咳疫苗免疫小鼠后，采用PSPT法和CHO中和抗體法檢測(cè)的百日咳抗體水平，并對(duì)其免疫效果進(jìn)行為期65周的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

 

1 材料與方法

 

1.1 樣品

 

共純化無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗、組分無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

 

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

 

BALb/C小鼠、雌性、6~8周、SPF級(jí)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0013。飼養(yǎng)于中國(guó)食品藥品檢定研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

 

1.3 主要試劑及儀器

 

PT、FHA標(biāo)準(zhǔn)抗原和CHO-K1細(xì)胞由中國(guó)食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室提供；WHO鼠源抗百日咳血清標(biāo)準(zhǔn)品97/642和WHO百日咳毒素標(biāo)準(zhǔn)品JNIH-5，簇集活性每支10000 IU，購(gòu)自英國(guó)生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定研究所（NIBSC）；抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體為美國(guó)Life Technologies公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基DMEM/F12（Cat. No. 21127-022）、胎牛血清（Cat. No. 10099-141）購(gòu)自美國(guó)Gbico公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀Spectra Max Plus購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；EVOS成像顯微鏡購(gòu)自美國(guó)AMG公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)THERMO公司。

 

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

 

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組（Lot1到Lot3試驗(yàn)組和PBS組，其中Lot1為進(jìn)口組分APV，Lot2為國(guó)內(nèi)處于新藥注冊(cè)階段組分APV，Lot3為國(guó)產(chǎn)共純化APV），每組10只，腹部皮下注射經(jīng)過(guò)5倍稀釋的樣品，0.5 mL/只，于免疫第28天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量同上。于免疫后第4周、第5周、第8周、第12周、第17周、第30周、第40周、第50周和第65周取血，采集后的小鼠血液離心后收集血清，-20℃冰箱保存待用。

 

1.5 百日咳特異性抗體IgG水平檢測(cè)

 

檢測(cè)小鼠血清中抗-PT和抗-FHA的含量，采用常規(guī)間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，以WHO鼠源抗百日咳血清標(biāo)準(zhǔn)品97/642作為標(biāo)準(zhǔn)（含抗PT-IgG 17 IU/支，抗FHA-IgG 143 IU/支）來(lái)計(jì)算血清中的抗體含量。PT、FHA包被抗原濃度均為3 μg·mL-1，置4 ℃冰箱過(guò)夜；洗板后按照實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)格式分別加入經(jīng)過(guò)稀釋后的待檢小鼠血清及標(biāo)準(zhǔn)品97/642，進(jìn)行2倍系列倍比稀釋直至酶標(biāo)板最后一排，之后按常規(guī)ELISA方法步驟檢測(cè)。終止顯色反應(yīng)后，使用SoftMax pro軟件，酶標(biāo)儀讀板，以WHO標(biāo)準(zhǔn)品97/642的數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用雙平行線分析方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定各種抗小鼠百日咳抗體的含量。

 

1.6 CHO細(xì)胞中和抗體滴度檢測(cè)

 

采用CHO細(xì)胞簇集試驗(yàn)[4]。將待測(cè)樣品和WHO鼠源抗百日咳血清參考品97/642（作為陽(yáng)性對(duì)照）進(jìn)行2倍系列稀釋，加入稀釋至0.4 IU·mL-1的PT毒素標(biāo)準(zhǔn)品JNIH-5進(jìn)行毒素中和，置37℃結(jié)合2 h；將中和完成的毒素樣品混合物加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的CHO細(xì)胞培養(yǎng)板中（細(xì)胞濃度3000個(gè)/孔），置5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。同時(shí)，設(shè)置只有PT毒素和CHO細(xì)胞的毒素對(duì)照、培養(yǎng)基對(duì)照和CHO細(xì)胞對(duì)照。樣品血清孔以顯示＜50%的細(xì)胞聚集的最高稀釋度為中和抗體的最后滴度?？寡尻?yáng)性對(duì)照應(yīng)有中和抗體滴度；毒素對(duì)照靈敏度應(yīng)小于0.03 IU·mL-1；培養(yǎng)基和細(xì)胞對(duì)照應(yīng)不簇集。

 

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

 

采用IBM SPSS Statistics 20軟件對(duì)抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)和CHO細(xì)胞中和抗體滴度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Spearman相關(guān)系數(shù)分析ELISA法P T抗體結(jié)果和C H O細(xì)胞中和抗體結(jié)果的相關(guān)性。

 

2 結(jié)果

 

2.1 抗體水平IgG檢測(cè)

 

將每組百日咳抗體檢測(cè)結(jié)果取平均值，轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)Log2后，進(jìn)行比較分析。如圖 1所示，免疫后第4周抗-PT和抗-FHA IgG水平均已升高，Lot1、Lot2組分APV組升高水平不及Lot3共純化APV組明顯；但是加強(qiáng)免疫后一周檢測(cè)，即第5周檢測(cè)結(jié)果顯示，Lot1、Lot2組升高明顯，Lot3組反而沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明Lot3組初次免疫后抗體水平就已明顯升高。3組疫苗在免疫后第12周抗體水平達(dá)到峰值，之后有所下降，組分APV組從第40周開(kāi)始、共純化APV組從第30周開(kāi)始抗體水平有顯著性下降（P＜0.05）。Lot1組和Lot2組的抗體水平比較，二者之間沒(méi)有顯著性差異；Lot1、Lot2組與Lot3組抗體水平比較，從第30周開(kāi)始，無(wú)論是抗-PT，還是抗-FHA IgG水平，Lot3組均顯著低于Lot1、Lot2組，均有顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)共純化APV疫苗免疫后抗體水平升高早，但是下降快，免疫持久性相對(duì)于組分APV疫苗組差。

 

  圖 1 小鼠免疫后第4周到第65周百日咳抗體檢測(cè)結(jié)果

 

2.2 中和抗體檢測(cè)

 

將3個(gè)試驗(yàn)組2 7次試驗(yàn)的C H O中和抗體和ELISA PT抗體的檢測(cè)結(jié)果取平均值，轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)Log2后作圖，見(jiàn)圖 2。結(jié)果顯示，雖然在免疫后第5周到第12周，3個(gè)試驗(yàn)組的抗-PT IgG水平?jīng)]有顯著性差別，見(jiàn)圖 1；但是，Lot3組的CHO中和抗體水平在免疫后第4周，即加強(qiáng)免疫前并不比Lot1、Lot2組差，而加強(qiáng)免疫后，卻顯著低于Lot1和Lot2組（P＜0.05）。隨著免疫后時(shí)間的延長(zhǎng)，Lot3組的中和抗體水平下降趨勢(shì)更加明顯。

 

圖 2 小鼠免疫后第4周到第65周百日咳毒素CHO中和抗體檢測(cè)結(jié)果

  

 

2.3 相關(guān)性分析

 

分別將各試驗(yàn)組的ELISA法PT抗體結(jié)果和CHO細(xì)胞中和抗體結(jié)果取對(duì)數(shù)后進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果分別為L(zhǎng)ot1組相關(guān)系數(shù)r=0.131，Lot2組相關(guān)系數(shù)r=0.200，Lot3組相關(guān)系數(shù)r=0.603，前兩組為低度相關(guān)，Lot3組為顯著相關(guān)。總體來(lái)說(shuō)，ELISA法檢測(cè)的抗-PT IgG水平與CHO中和試驗(yàn)檢測(cè)的PT中和抗體水平之間具有一定的相關(guān)性。

 

3 討論

 

無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗有效性評(píng)價(jià)主要有兩種方法，即小鼠血清學(xué)效力方法和改良腦腔攻擊法（Modified Intracerebral Challenge Assay，MICA）。我國(guó)一直采用MICA法用于百日咳疫苗效力試驗(yàn)的放行。小鼠血清學(xué)效力法主要是應(yīng)用ELISA法檢測(cè)疫苗中各百日咳抗原組分在免疫小鼠后的抗體免疫反應(yīng)，該方法在歐美國(guó)家已廣泛用于評(píng)價(jià)疫苗的有效性[5-6]。CHO細(xì)胞中和抗體法，主要檢測(cè)的是百日咳主要抗原PT誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體，而通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)到的抗體為結(jié)合抗體，中和抗體肯定具有結(jié)合抗體的性質(zhì)，但結(jié)合抗體不一定具有中和活性。

 

本實(shí)驗(yàn)中，采用ELISA法和CHO中和抗體法檢測(cè)疫苗免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體應(yīng)答，并連續(xù)監(jiān)測(cè)至免疫后第65周，評(píng)價(jià)組分APV和共純化APV在小鼠體內(nèi)的抗體應(yīng)答和免疫持久性。結(jié)果顯示，ELISA法檢測(cè)的結(jié)合抗體，組分APV與共純化APV相比，在免疫后早期，到第30周，二者之間的抗體水平差異不顯著，隨后，雖然百日咳抗體水平都有下降趨勢(shì)，但共純化APV組下降更加明顯，顯著低于組分APV組。CHO細(xì)胞法檢測(cè)的PT中和抗體，在免疫后第4周，此時(shí)尚未加強(qiáng)免疫，共純化APV組的中和抗體水平與組分APV組的Lot1組沒(méi)有顯著差異，且高于Lot2組；但在加強(qiáng)免疫后，組分APV組的中和抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于共純化APV組（P ＜0.05）。統(tǒng)計(jì)學(xué)Spearman相關(guān)性分析顯示，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有一定的相關(guān)性，Lot1、Lot2組為低度相關(guān)，Lot3組為顯著相關(guān)。雖然此次試驗(yàn)選取的樣本數(shù)量有限，但總體來(lái)說(shuō)，ELISA法檢測(cè)的抗-PT IgG水平與CHO中和試驗(yàn)檢測(cè)的PT中和抗體水平之間具有一定的相關(guān)性，表明兩種檢測(cè)方法結(jié)合使用可更加全面反映抗原的免疫原性[7]。此外，PT中和抗體檢測(cè)方法及其質(zhì)量控制研究一直是本實(shí)驗(yàn)室正在研究項(xiàng)目的重點(diǎn)之一，最終目標(biāo)是以這種相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷、符合動(dòng)物使用3R原則的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，替代目前我國(guó)使用的MICA法。MICA法試驗(yàn)周期長(zhǎng)，使用動(dòng)物數(shù)量大，影響因素多。中和抗體的檢測(cè)在后續(xù)研究中將進(jìn)一步細(xì)化以積累更多數(shù)據(jù)。

 

綜上所述，無(wú)論哪種工藝生產(chǎn)的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗，免疫小鼠后均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。在誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力上，兩種類型的百日咳疫苗在免疫后前期，ELISA法檢測(cè)的抗體水平?jīng)]有顯著性差異，但隨著監(jiān)測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，共純化苗組的抗體水平下降趨勢(shì)較組分苗組顯著。中和抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，共純化苗組顯著低于組分苗組。

 

參考文獻(xiàn)

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