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目前高效液相色譜法比較常用的是反相色譜法（RPC），但有時對于一些樣品的檢測和分離必須添加離子對試劑，否則化合物無法達(dá)到一個好的保留，故離子對色譜法（IPC）也是一名分析工作者需要掌握的知識。

 

今天編者主要與大家分享下離子對色譜法的工作原理、離子對試劑使用原則以及影響離子對色譜法的主要因素等內(nèi)容，希望能夠給大家在應(yīng)用離子對色譜法時有所幫助。

 

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 工作原理

當(dāng)流動相中加入離子對試劑R⁺或者R^-，這些試劑被色譜柱的固定相進(jìn)行保留，然后溶質(zhì)進(jìn)入色譜柱后與離子對試劑進(jìn)行離子的交換，從而改變化合物的保留。

 

一般流動相中加入陰離子型試劑時，電離的堿性化合物會保留增加；中性化合物因色譜柱的固定相表面被離子對試劑吸附，造成部分被阻塞，使得中性化合物的保留時間減少；對于酸性化合物因酸性離子和固定相中的離子對試劑相互排斥，加上固定相被部分離子對試劑堵塞，使得酸性化合物的保留時間減少。當(dāng)流動相中加入陽離子型試劑時，電離的酸性化合物保留增加，中性和（尤其是）堿性化合物的保留會減少。

 

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 與反向色譜法相比較優(yōu)勢

在流動相中添加離子對試劑可以改善堿性物質(zhì)色譜峰的拖尾，增加原本保留很弱的酸性或者堿性離子化合物的保留（并且k值合理）。其和反向色譜法中改變流動相pH導(dǎo)致化合物的保留時間變化性質(zhì)差不多，但是離子對色譜法能夠更好的控制酸性或者堿性化合物的保留行為，而且無須使用極端的流動相pH（pH小于2.5或者大于8）。

 

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  什么情況流動相需使用離子對試劑

（1）被分析化合物是離子型樣品。

（2）當(dāng)改變反向色譜法的其他條件被分析的化合物仍無法得到一個很好的保留，或者更換各種條件無法得到一個較好的分離度時。

（3）當(dāng)且僅當(dāng)需要時才使用！

 

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  使用離子對試劑的前提

是對需要已知某個峰應(yīng)一份酸性物質(zhì)、堿性物質(zhì)或是中性物質(zhì)，只有這樣我們才可以進(jìn)行準(zhǔn)確去預(yù)測出需要添加的離子對試劑對于溶質(zhì)的保留的影響。

 

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  離子對試劑選擇原則

一般對于酸性化合物選擇四烷基銨鹽R₄N⁺(R⁺)；對于堿性化合物選擇烷基磺酸鹽R-SO3^-(R^-)；有機(jī)試劑一般推薦選擇使用甲醇，因?yàn)檫@些離子對試劑在甲醇中有更好的溶解度。對于同時有酸有堿的化合物推薦開始使用低pH的流動相加上烷基磺酸鹽，因?yàn)榈?/span>pH抑制酸性離子化，離子對試劑增強(qiáng)堿性物質(zhì)的保留。

 

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  影響離子對色譜法因素

（1）離子對試劑濃度的影響

 

a.離子對試劑濃度對于化合物的保留的影響，見下圖：

假設(shè)被分析的化合物的濃度一定，當(dāng)逐步提高流動相中離子對試劑的濃度時化合物的保留會逐漸增大；當(dāng)離子對試劑濃度繼續(xù)增加到色譜柱的固定相被飽和時，化合物的保留達(dá)到最大值；繼續(xù)增加離子對試劑濃度，流動相中會伴隨離子對試劑的反離子濃度的增加，反離子會與化合物進(jìn)行競爭離子的交換保留，導(dǎo)致化合物的保留呈逐漸下降的趨勢。

 

b.離子對試劑濃度的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)⁽¹⁾研究：不同磺酸鹽或季銨鹽的推薦起始濃度對流動相中的%-甲醇作圖如下：

例如，假定使用40%甲醇的流動相，同時加入烷基磺酸鹽作為離子對試劑，根據(jù)上圖75mmol/L的正辛烷磺酸鹽、15mmol/L的癸烷磺酸鹽都是合適的起始條件。一般選擇離子對試劑濃度時建議選擇圖中非陰影部分濃度，通常離子對試劑的最佳初始濃度為100mmo l/L。此時該濃度會令試劑覆蓋色譜柱大約三分之一的固定相表面。

 

（2）離子對試劑的類型的影響

 

一般離子對試劑疏水性越強(qiáng)，化合物與之結(jié)合后在色譜柱的保留越強(qiáng)。如對于酸性化合物，要達(dá)到同一保留時間，選用TBA⁺（含16個碳原子）時濃度比TEA⁺（含8個碳原子）濃度低。

 

（3）流動相pH的影響

 

當(dāng)在流動相中添加離子對試劑后，如酸性化合物提高pH值會使得酸性化合物的離子狀態(tài)增加，此時會增加其與離子對試劑的接觸，增加其保留，故提高pH值使得酸性化合物的保留增強(qiáng)，這個與其在不加離子對試劑時調(diào)高pH值降低酸性化合物的保留相反。同時對于堿性化合物提高pH值使得分子狀態(tài)增加，會降低其與離子對試劑的結(jié)合，導(dǎo)致化合物的保留減弱。

 

（4）溫度的影響

 

相對于RPC，離子對色譜法對于溫度控制的要求更高，溫度的重現(xiàn)性必須較高。否則溫度的改變?nèi)菀滓鸹衔锵鄬ΡＡ舯容^明顯的變化，進(jìn)而影響化合物的分離。

 

（5）有機(jī)溶劑（B%）強(qiáng)度的影響

 

改變B%的比例對化合物保留的影響同RPC分離樣品時差不多，但IPC還有自己的特點(diǎn)，如增加B%的比例（對于添加磺酸鹽作為離子對試劑的流動相），所有的化合物的保留時間會減少，但是對于堿性化合物的保留減少更多。

 

（6）色譜柱的影響

 

色譜柱因?yàn)楸浑x子對試劑部分覆蓋，因此色譜柱對化合物保留的實(shí)際作用往往被覆蓋。通過改變色譜柱控制分離目的不是首選，也不會特別有效。

 

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  其他注意問題

（1）流動相控制pH需更加嚴(yán)格（±0.1個單位或者更高）

（2）添加離子對試劑的檢測建議使用210nm以上

（3）添加離子對試劑的流動相平衡較慢

 

因離子對試劑在色譜柱的吸附和解析附過程非常緩慢，通常新的流動相需要進(jìn)行幾個小時的沖洗才能夠達(dá)到完全平衡，有條件的可以進(jìn)行過夜平衡12小時以上，否則在進(jìn)樣過程中化合物保留時間會慢慢的偏移。因此使用離子對試劑時不建議使用梯度洗脫方式。

 

（4）更換離子對試劑 

 

當(dāng)需要進(jìn)行更換離子對試劑時，需要先把原來的離子對試劑進(jìn)行洗脫下來，再用新的流動相進(jìn)行平衡。一般烷基磺酸鹽可以使用50%-80%的甲醇-水進(jìn)行洗脫；季銨鹽需要使用50%甲醇-緩沖液（pH4-5的100mmol/L的磷酸二氫鉀）。要求至少使用等于柱體積的20倍進(jìn)行沖洗色譜柱，再用新的流動相進(jìn)行平衡色譜柱。

 

因此對于已用于 IPC 分離的色譜柱不要用于展開不含 IPC 試劑的 RPC 分離；從一種離子對試劑變?yōu)榱硗庖环N使用同一根色譜柱是可以的。

 

（5）容易出現(xiàn)偽峰

 

隨行需要進(jìn)樣空白進(jìn)行比較去除偽峰，當(dāng)使用不純的離子對試劑會較容易產(chǎn)生偽峰，此時建議更換使用不同批次或者來源的離子對試劑。

 

小結(jié)：總的來說當(dāng)根據(jù)RPC方法初步摸索確定必須要使用離子對試劑時，首先根據(jù)化合物峰的酸堿性（通過改變pH來判斷）確定添加哪種類型的離子對試劑；然后加入一個初始濃度的離子對試劑；最后通過改變流動相B%或者溫度、流動相pH及離子對試劑濃度進(jìn)行調(diào)整選擇性。

 

參考文獻(xiàn)：

(1)AkosBartha,GyulaVigh,ZitaVarga-Puchony.Basis of the rational selection of the hydrophobicity and concentration of the ion-pairing reagent in reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatography[J],Journal of Chromatography A,1990（499）:423-434.

(2)Lloyd R.Snyder, Joseph J.Kirkland, John W.Doln，譯：陳曉明，唐雅妍。現(xiàn)代液相色譜技術(shù)導(dǎo)論（第三版）。