正文：
芳香胺類化合物（結(jié)構(gòu)見圖1）是醫(yī)藥工業(yè)中常用的原料，例如雙氯芬酸鈉的合成過程中使用了2,6-二氯苯胺作為起始原料、苯磺酸拉帕替尼的制備中以4-（3-氟苯甲氧基）-3-氯苯胺作為合成工藝的中間體，由于該類化合物結(jié)構(gòu)中芳香烴的苯環(huán)與胺基的氮原子相連接，分子比較活躍，經(jīng)代謝活化生成穩(wěn)定的氮正離子（ArN+H），此離子能與DNA結(jié)合，具有致癌性和致突變性，特別是更易形成氮正離子結(jié)構(gòu)的芳香胺的毒性更強。
芳香胺類化物具有警示結(jié)構(gòu)，是已知的潛在基因毒性雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)種類繁多，是基因毒性雜質(zhì)中較為常見的一類。藥品生產(chǎn)過程中是否有芳香胺類化合物的殘留已成為現(xiàn)階段藥物研究過程中重要討論和控制的內(nèi)容，也已成為國內(nèi)外藥品注冊審評不可缺少的項目，因此需要建立一種專屬性強、靈敏度高的方法對該類雜質(zhì)進行控制。
根據(jù)參考各國藥典及文獻，總結(jié)了部分含有芳香胺類化合物類基因毒雜質(zhì)藥物的種類，詳見表1。表1. 含有芳香胺類化合物類基因毒雜質(zhì)藥物列表
直接檢測法：
目前芳香胺類化合物的檢測方法較多，大多采用常規(guī)檢測的方法，如GC 法、HPLC 法、GC-MS 法和LC-MS 法。據(jù)文獻報道，有直接使用GC-MS的方法并采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式，直接測定吉非替尼原料藥中3,4-二氯苯胺雜質(zhì)的殘留；利用LC-MS-MS的方法，在電噴霧離子化（ESI），正離子模式下MRM 采集，直接測定氟胞嘧啶中痕量基因毒性雜質(zhì)N，N-二甲基苯胺的含量。值得注意的是，根據(jù)芳香胺的極性和弱堿性的差異，在利用GC 法進行檢測時，可以使用不同的檢測器以增加對特定胺的選擇性，包括氮磷檢測器、火焰光度檢測器和電子捕獲檢測器等。
其他方法：
為了提高芳香胺類化合物的檢測靈敏度，在檢測前一般需進行樣品預(yù)處理以分離富集痕量的芳香胺。有文獻報道，利用陽離子交換柱的SPE技術(shù)對所檢測的芳香胺進行富集，然后通過LC-MS的手段檢測分析了22 種芳香胺的含量，SPE不僅能對芳香胺進行濃縮，還能消除基質(zhì)殘留對質(zhì)譜離子化的不利影響，因此建立了一個高靈敏度和準確度的芳香胺的定量方法。還有采用SPME作為前處理方法，該方法作為無溶劑的萃取技術(shù)，與SPE技術(shù)相比更加簡單快速。文獻報道，以聚苯胺作為SPME的吸附涂層，并結(jié)合HS-GC-FID檢測技術(shù)檢測了6種芳香胺基因毒雜質(zhì)，靈敏度為0.019~1.06μg/L。除此之外，芳香胺類化合物還能夠經(jīng)過衍生化處理后進行檢測，該方法可以改善雜質(zhì)與色譜柱相互作用而導(dǎo)致的峰形拖尾問題，同時還能提高檢測的靈敏度。
利伐沙班（Rivaroxaban，化合物1，圖2），是口服直接Xa因子抑制劑，臨床用于預(yù)防和治療靜脈血栓，預(yù)防髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)后的靜脈血栓及預(yù)防非瓣膜性房顫的靜脈血栓。在利伐沙班的合成工藝（圖2）中，其中4-(4-氨基苯基)-3-嗎啉酮為合成利伐沙班的中心前體，與化合物2-[(2S)- 2-環(huán)氧乙烷基甲基]-1異吲哚-1及3-(2H)-二酮和5-氯噻吩-2-碳酰氯為原料合成利伐沙班，4-(4-氨基苯基)-3-嗎啉酮可能殘留于利伐沙班形成雜質(zhì)。4-(4-氨基苯基)-3-嗎啉酮結(jié)構(gòu)中含有基因毒性警示結(jié)構(gòu)苯胺基團，具有潛在基因毒性，因此必須對其進行嚴格控制。基于TTC，以利伐沙班口服劑量10 mg/d計算，4- (4-氨基苯基)-3-嗎啉酮的限度須不超過150 ppm。
因此，采用HPLC直接檢測的方法測定4-(4-氨基苯基)-3-嗎啉酮（化合物2）。根據(jù)ICH指南要求，對該方法進行了檢測限、定量限、線性、精密度、準確性等相關(guān)驗證，4-(4-氨基苯基)-3-嗎啉酮在20.12-201.2ng/mL的范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9981，4-(4-氨基苯基)-3-嗎啉酮的LOD和LOQ分別能夠達到10.1ng/mL及30.3ng/mL，平均回收率為97.4%，本法靈敏、可靠、簡便/操作簡單且無機制干擾，適合在痕量水平下對利伐他班中基因毒雜質(zhì)進行控制，為利伐沙班工藝過程控制和質(zhì)量保障提供參考依據(jù)。
托拉塞米:
托拉塞米（Torasemide，化合物6，圖3）是歐洲許多國家上市的一種新型降壓利尿藥，廣泛用于治療高血壓、心力衰竭等各種浮腫性疾病。托拉塞米的合成工藝中以4-羥基吡啶為原料，加入濃硫酸反應(yīng)得到中間體8，然后加入五氯化磷和三氯氧磷反應(yīng)得到中間體9，用氨氣飽和析出沉淀得到中間體10，再加入間甲苯胺（化合物11，圖3）和異丙氨基甲酸甲酯為反應(yīng)溶劑得到托拉塞米成品，該工藝所用的間甲苯胺含有遺傳毒性致癌性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)，因此，依據(jù)EMA和FDA相應(yīng)的指導(dǎo)原則，有必要對托拉塞米中的間苯甲胺的殘留進行定量分析。根據(jù)ICH發(fā)布基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 μg/d計算，卡維地洛最大日劑用量為100mg/d，則對應(yīng)的基因毒性雜質(zhì)間苯甲胺的TTC水平為15ppm。
因此，采用LC-MS直接檢測的方法對4-(2,3-環(huán)氧丙氧基)-9H-咔唑進行定量，在該方法下LOQ為2.68μg/g，LOD為0.825μg/g，在0.2~22.5μg/g的濃度范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，回收率為96.7-101.5%。該方法快速、簡單、準確且經(jīng)全面驗證后符合檢測的需求。
芳香胺類化合物作為潛在的基因毒性雜質(zhì)，通常作為起始物料、反應(yīng)試劑或中間體存在于藥物合成過程中，這些物料通常會作為雜質(zhì)存在于終產(chǎn)品中，可能具有遺傳毒性和致癌性而危害病人的健康。因此，藥品中如果含有上述物質(zhì)以基因毒性雜質(zhì)的形式存在時，藥品的質(zhì)量就會存在潛在的風險，對人類健康造成威脅。由于芳香胺類化合物種類繁多，且化學(xué)性質(zhì)各異，因此需從靈敏度、選擇性、待測物穩(wěn)定性、基質(zhì)復(fù)雜性等進行全方面分析，選擇合適的分析檢測手段。
藥品中基因毒性雜質(zhì)研究的最大的挑戰(zhàn)就是調(diào)節(jié)好基毒雜質(zhì)的危害最小化和企業(yè)開發(fā)藥品成本之間的平衡。基因毒性雜質(zhì)研究需要更多的時間和資源，其研究內(nèi)容包括控制策略及限度的設(shè)定、分析方法研究、驗證以及放行檢測，這些無疑將延遲藥品申報及上市時間，同時增加藥品的研發(fā)成本。因此，采用合適的手段來控制產(chǎn)品中的基因毒性雜質(zhì)是非常必要的。EMEA和FDA指南以及ICH M7都明確要求充分評估基因毒性雜質(zhì)的風險，控制原料藥和藥品中基因毒性雜質(zhì)的殘留限度。為了滿足申報要求，建立科學(xué)的控制策略，使實際工藝中所有可能涉及的基因毒性雜質(zhì)的風險得到明確鑒別和控制，以保證和提高藥品的質(zhì)量。
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