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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2019-11-12 15:38
摘要
在QbD理念下進(jìn)行分析方法的開發(fā)與設(shè)計(jì)，應(yīng)當(dāng)評(píng)估基于檢測(cè)結(jié)果的做出錯(cuò)誤決策的風(fēng)險(xiǎn)水平，即對(duì)分析方法檢測(cè)結(jié)果的誤差進(jìn)行系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。
一、概念誤差解析
誤差為測(cè)量值與真實(shí)值之差。按照誤差的性質(zhì)與特點(diǎn)，誤差可分為隨機(jī)誤差、系統(tǒng)誤差、粗大誤差三大類。
隨機(jī)誤差：在同一測(cè)量條件下，多次重復(fù)測(cè)量同一量值時(shí)，測(cè)量誤差的絕對(duì)值與正負(fù)符合以不可預(yù)知的方式變化。
系統(tǒng)誤差：在同一測(cè)量條件下，多次重復(fù)測(cè)量同一量值時(shí)，測(cè)量誤差的絕對(duì)值與正負(fù)符合都保持不變，或在測(cè)量條件改變時(shí)按一定規(guī)律變化。
粗大誤差：由于測(cè)量者的粗心大意，或者環(huán)境的突然變化而引起【1】。
二、分析方法的誤差設(shè)計(jì)概述
作為分析方法質(zhì)量的一個(gè)環(huán)節(jié)，誤差的設(shè)計(jì)同樣適用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）的相關(guān)理念，如質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理、設(shè)計(jì)空間、生命周期。對(duì)于分析方法的質(zhì)量來(lái)說(shuō)，檢測(cè)結(jié)果的誤差是一個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)當(dāng)對(duì)誤差允許的范圍（即誤差的設(shè)計(jì)空間）、分析方法的全生命周期的誤差的來(lái)源及程度進(jìn)行評(píng)估，尤其是對(duì)于精度要求高的檢測(cè)項(xiàng)目，如含量測(cè)定。
分析方法的誤差有多個(gè)來(lái)源于，包括隨機(jī)誤差、系統(tǒng)誤差、粗大誤差。在設(shè)計(jì)分析方法的誤差時(shí)，應(yīng)當(dāng)首先根據(jù)外部要求確定該方法允許的誤差限度，然后根據(jù)誤差的合成與分配原理，制定對(duì)不同來(lái)源誤差的可接受限度。根據(jù)在方法開發(fā)過程中對(duì)方法性能的理解，決定使用先驗(yàn)知識(shí)或統(tǒng)計(jì)學(xué)理論、工具對(duì)方法誤差進(jìn)行評(píng)價(jià)。在對(duì)不同來(lái)源的誤差進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析時(shí)，可根據(jù)對(duì)外部要求與方法性能的理解，決定采用定性分析或者定量分析或者二者結(jié)合的方式。
在方法開發(fā)過程中，應(yīng)當(dāng)對(duì)方法的誤差進(jìn)行系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并根據(jù)評(píng)估的結(jié)果決定是否以及如何優(yōu)化分析方法的相關(guān)參數(shù)。
對(duì)分析方法誤差的研究結(jié)論應(yīng)當(dāng)作為分析方法相關(guān)知識(shí)的一部分整合到分析方法的知識(shí)庫(kù)中，按照實(shí)驗(yàn)室的知識(shí)管理相關(guān)規(guī)定，根據(jù)需要進(jìn)行共享，以支持分析方法生命周期其他階段的活動(dòng)，如方法驗(yàn)證、方法轉(zhuǎn)移、日常監(jiān)測(cè)以及方法變更等。在分析方法的全生命周期中，需及時(shí)根據(jù)最新的研究成果更新誤差的知識(shí)。
例1：如何根據(jù)外部要求確定方法允許的誤差
某原料藥的含量測(cè)定可接受標(biāo)準(zhǔn)為98.0%~102.0%，多批次實(shí)際檢測(cè)結(jié)果為99.0%~100.5%。方法允許的誤差為（99.0%-98.0%=1.0%，102.0%-100.5%=1.5%；二者取小值）1.0%。
三、分析方法的隨機(jī)誤差
分析方法的隨機(jī)誤差有多個(gè)來(lái)源，如儀器的響應(yīng)、樣本屬性、樣品制備過程等。在進(jìn)行方法的誤差設(shè)計(jì)時(shí)，需要評(píng)估隨機(jī)誤差的風(fēng)險(xiǎn)。如隨機(jī)誤差超過了允許的范圍，首先可以選擇優(yōu)化方法的參數(shù)，使誤差減輕至可接受的程度，也可以通過多次測(cè)定取均值的方式減輕，但是增加測(cè)定次數(shù)可能導(dǎo)致分析時(shí)間及成本的大幅上升。復(fù)測(cè)的要求應(yīng)當(dāng)在分析方法中明確規(guī)定。
例2：儀器響應(yīng)誤差的評(píng)估（HPLC）
儀器響應(yīng)對(duì)于分析方法多數(shù)情況下是一個(gè)隨機(jī)誤差，需要評(píng)估是否超過允許的范圍。如例1的原料藥含量測(cè)定，假設(shè)經(jīng)過誤差的分配，1%的總誤差分配的進(jìn)樣允許誤差為0.5%，則需評(píng)估連續(xù)進(jìn)樣的RSD?？梢允褂媒y(tǒng)計(jì)學(xué)的原理對(duì)其進(jìn)行定量的分析，其計(jì)算公式如下*1：
其中E為允許的誤差；Z為特定置信水平下的Z值，為一常數(shù)；n為連續(xù)進(jìn)樣的次數(shù)。如期望95%*2的概率（Z值為1.96）單次進(jìn)樣的檢測(cè)結(jié)果不超過允許的誤差限度0.5%，將Z=1.96，E=0.5%，n=1分別代入公式，得出連續(xù)進(jìn)樣RSD = 0.25%。即該方法儀器響應(yīng)的RSD不得過0.25%。
如果儀器響應(yīng)的RSD已經(jīng)優(yōu)化至不能減輕，則需要評(píng)估是否需要多次進(jìn)樣分析，其計(jì)算公式如下：
其中σ為連續(xù)進(jìn)樣的標(biāo)準(zhǔn)差。假設(shè)連續(xù)進(jìn)樣的RSD為1%，欲使檢測(cè)結(jié)果的誤差在95%的概率上不超過允許的誤差，將Z=1.96，E=0.5%，σ=1%分別代入公式，得出平行進(jìn)樣的次數(shù)為15.4（修約至16）。即在規(guī)定條件下該方法需平行測(cè)定16次取均值，才能滿足誤差的要求。
*1:該計(jì)算公式源于置信區(qū)間計(jì)算公式的變形。
*2：是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的置信水平的概念，在方法開發(fā)時(shí)置信水平可以適當(dāng)調(diào)整，但應(yīng)當(dāng)作為分析方法知識(shí)的一部分記錄入知識(shí)庫(kù)中。
樣本屬性的誤差評(píng)估
由于成本以及技術(shù)上的可行性等因素的限制，檢測(cè)在大多數(shù)情況下是用樣本屬性評(píng)估總體屬性，即在實(shí)踐中一般是使用抽樣檢測(cè)的方式評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量。抽樣檢測(cè)必然要求樣本的屬性在一定程度上能代表總體屬性，但是如果總體中的個(gè)體之間屬性存在差異，則需評(píng)估樣本屬性誤差的風(fēng)險(xiǎn)。
一般來(lái)說(shuō)樣本容量越接近總體時(shí)，其屬性越接近總體屬性，即檢測(cè)結(jié)果誤差越小；但是由于經(jīng)濟(jì)與可行性等因素的制約，樣本容量一般不宜過大。
在設(shè)計(jì)分析方法樣本屬性的誤差時(shí)，由于不能改變樣本中個(gè)體屬性之間的差異，只能通過調(diào)整樣本量的方式來(lái)控制檢測(cè)結(jié)果的誤差不超過誤差設(shè)計(jì)時(shí)被分配的限度。樣本量的計(jì)算方法同例2中的進(jìn)樣次數(shù)，公式中σ為個(gè)體間屬性的標(biāo)準(zhǔn)差。
原料藥大多情況下可以認(rèn)為是均勻的樣品，樣本屬性的誤差風(fēng)險(xiǎn)較??；而制劑如片劑、膠囊等個(gè)體間的屬性存在差異，尤其是在含量測(cè)定、溶出度等檢測(cè)項(xiàng)目中，在進(jìn)行相關(guān)方法的開發(fā)時(shí)，應(yīng)當(dāng)評(píng)估樣本容量的風(fēng)險(xiǎn)。
樣品制備過程
樣品制備過程中，可能會(huì)用到稱量、溶解、移液、萃取、過濾、衍生化等操作，這些操作都會(huì)增加檢測(cè)結(jié)果誤差的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于稱量、溶解、移液等操作，可以通過評(píng)估稱量值、容量瓶體積、量取體積等評(píng)估相應(yīng)過程的誤差；而對(duì)于萃取、衍生化等高風(fēng)險(xiǎn)操作，必要時(shí)可以通過多次檢測(cè)平行樣品的方式評(píng)價(jià)誤差的水平，以確認(rèn)是否需要多次制備樣品。樣品制備次數(shù)的計(jì)算方法同例2中的進(jìn)樣次數(shù)，公式中σ為平行樣品間檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差。
四、分析方法的系統(tǒng)誤差
分析方法中存在多個(gè)系統(tǒng)誤差來(lái)源，主要分為兩類，是與分析方法無(wú)關(guān)的或者有關(guān)的。對(duì)照品含量、量具等來(lái)源的與分析方法無(wú)關(guān)的系統(tǒng)誤差，在分析方法開發(fā)過程中無(wú)法優(yōu)化，主要有實(shí)驗(yàn)室的對(duì)照品標(biāo)定、量具校正等相關(guān)規(guī)定控制相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；而如溶液穩(wěn)定性、流動(dòng)相本底吸收、組分提取等來(lái)源的與分析方法有關(guān)的系統(tǒng)誤差，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化至可接受的程度。
系統(tǒng)誤差允許的限度，需要結(jié)合分析方法的隨機(jī)誤差進(jìn)行評(píng)估，使得分析方法的總誤差不超過根據(jù)外部條件確定的限制。由于系統(tǒng)誤差不能通過復(fù)測(cè)減輕，如果方法的系統(tǒng)誤差過大，可能對(duì)隨機(jī)誤差的要求就會(huì)非常嚴(yán)格。因此應(yīng)當(dāng)評(píng)估方法的系統(tǒng)誤差的風(fēng)險(xiǎn)，如系統(tǒng)誤差無(wú)法優(yōu)化至可接受的程度，則可能需要另行開發(fā)新的方法。
溶液穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要從待測(cè)組分的降解、稀釋劑的變化（如揮發(fā)、吸收冷凝水）兩個(gè)方面進(jìn)行。溶液穩(wěn)定性引入的誤差應(yīng)當(dāng)根據(jù)誤差分配的原理確定相應(yīng)的限度，然而目前對(duì)溶液穩(wěn)定性允許的誤差一般同方法驗(yàn)證的精密度，該要求均過于寬松。如例1中方法允許的總誤差為1%，評(píng)價(jià)溶液穩(wěn)定性的允許誤差不得設(shè)置為1%，應(yīng)當(dāng)是在扣除其他系統(tǒng)誤差與隨機(jī)誤差后的值，如0.25%。
如分析方法存在溶液穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)，如能觀察到明顯的待測(cè)組分的降解或者稀釋劑的變化，應(yīng)當(dāng)確定相應(yīng)溶液滿足允許的誤差的貯存時(shí)間。由于溶液穩(wěn)定性與外界環(huán)境如溫度、濕度等密切相關(guān)，而外界環(huán)境存在不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)，因此必要時(shí)需研究溶液穩(wěn)定性的耐用性，即在不同環(huán)境條件下分別研究穩(wěn)定性變化的程度與貯存時(shí)間，并做回歸分析，提供預(yù)測(cè)溶液可用時(shí)間的穩(wěn)定性變化程度的置信區(qū)間，其下限應(yīng)不得超過允許的限制。
對(duì)于高效液相色譜法來(lái)說(shuō)，如采用紫外-可見光檢測(cè)器，流動(dòng)相的本底吸收很多時(shí)候是一個(gè)不可忽視的問題，如檢測(cè)波長(zhǎng)為小于205nm或者接近流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)等情況，特別是對(duì)于靈敏度要求較高的雜質(zhì)檢測(cè)方法。
流動(dòng)相的本底吸收如果較強(qiáng)，可能會(huì)給分析方法帶來(lái)許多問題，包括更強(qiáng)的基線噪音、更差的靈敏度、更大的響應(yīng)誤差等，也會(huì)給分析方法生命周期中的其他環(huán)節(jié)留下風(fēng)險(xiǎn)，如雜質(zhì)檢測(cè)的方法驗(yàn)證中低濃度水平的回收率過低、線性截距過大，或者方法轉(zhuǎn)移過程中對(duì)比實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果相差過大等。
為減少流動(dòng)相本底吸收的風(fēng)險(xiǎn)，波長(zhǎng)應(yīng)盡量避免較低的波長(zhǎng)（＜205nm），或者應(yīng)大于流動(dòng)相截止波長(zhǎng)10nm以上；如波長(zhǎng)選擇不能滿足該要求，應(yīng)當(dāng)在方法開發(fā)階段審慎地評(píng)估相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證，并規(guī)定適宜的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。
在對(duì)樣品進(jìn)行萃取過程中萃取效果不完全，或衍生化效果不完全，或者在研磨、溶解、過濾等過程中由于輔料、器材的吸附導(dǎo)致待測(cè)組分與理想狀態(tài)不一致，對(duì)于這類誤差，如果較為嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)首選優(yōu)化樣品處理方法以減輕誤差；完成優(yōu)化后，應(yīng)當(dāng)評(píng)估該誤差是否符合被分配的限度。
如果優(yōu)化后，組分提取的誤差仍然不能滿足要求，可采用改變計(jì)算方法如內(nèi)標(biāo)法減輕該誤差引入的風(fēng)險(xiǎn)。
五、分析方法的粗大誤差
在樣品的檢測(cè)過程中，可能會(huì)存在多個(gè)粗大誤差，如儀器故障、停電、錯(cuò)誤的計(jì)算公式、操作失誤等。這些不同來(lái)源的粗大誤差多數(shù)與方法開發(fā)沒有直接聯(lián)系，而是由實(shí)驗(yàn)室的其他相關(guān)管理制度進(jìn)行監(jiān)控，如儀器故障的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)當(dāng)由實(shí)驗(yàn)室的儀器維護(hù)等規(guī)程管理。但是其中許多人為因素導(dǎo)致的粗大誤差如使用了錯(cuò)誤的計(jì)算公式、操作失誤等可以在方法開發(fā)期間進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑u(píng)估。
在分析方法的開發(fā)與設(shè)計(jì)時(shí)，如果是可選的，則方法應(yīng)考慮到操作不得超過實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有人員的一般水平，設(shè)計(jì)的計(jì)算方法與樣品處理等內(nèi)容應(yīng)盡可能的簡(jiǎn)易，方法使用的設(shè)備、器材、試劑等應(yīng)盡可能為實(shí)驗(yàn)室常用，以減少由于方法過于復(fù)雜導(dǎo)致的粗大誤差發(fā)生的概率。其原則為：如果可以，方法應(yīng)盡可能簡(jiǎn)易，為人所熟悉。
6、結(jié)束語(yǔ)
對(duì)分析方法的誤差進(jìn)行設(shè)計(jì)，是方法開發(fā)非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，但是目前對(duì)此并沒有足夠的認(rèn)識(shí)，筆者撰寫本文的目的就是希望提出一些相關(guān)的理念，拋磚引玉，引發(fā)相關(guān)從業(yè)人員對(duì)這一環(huán)節(jié)的重視、思考與討論，并逐步完善相關(guān)研究的理論與方法。
本文中提起的隨機(jī)誤差、系統(tǒng)誤差、粗大誤差的相關(guān)分類與案例，并未囊括實(shí)踐中所有的情況，可按照本文的理念結(jié)合實(shí)際情況對(duì)實(shí)踐中的誤差進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計(jì)。
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