中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

遺傳毒性試驗(yàn)是采用哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母菌、真菌或整體動(dòng)物測(cè)定試驗(yàn)樣品是否會(huì)引起基因突變、染色體結(jié)構(gòu)畸變以及其他DNA或基因變化的試驗(yàn)。遺傳毒性試驗(yàn)的主要目的是研究醫(yī)療產(chǎn)品導(dǎo)致人體基因改變，并能通過(guò)生殖細(xì)胞傳遞至下一代的潛力。

遺傳毒性試驗(yàn)用于檢測(cè)兩類主要的遺傳損傷：基因突變（點(diǎn)突變）和染色體損傷（結(jié)構(gòu)畸變、數(shù)目畸變）。單一試驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)出所有相關(guān)遺傳毒性物質(zhì)，通常進(jìn)行一組試驗(yàn)，試驗(yàn)組合包括：細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)，體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)，體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)。

如果按照以上進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)且兩個(gè)體外試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性，則不需進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)。如果任意體外遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果為陽(yáng)性，則應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)誘變性試驗(yàn)，否則推定為誘變物。應(yīng)在體外試驗(yàn)確定出的最適宜終點(diǎn)的基礎(chǔ)上選擇相應(yīng)的體內(nèi)試驗(yàn)，通常采用的體內(nèi)試驗(yàn)有：嚙齒動(dòng)物體內(nèi)微核試驗(yàn)，嚙齒動(dòng)物骨髓中期分析，轉(zhuǎn)基因基因突變?cè)囼?yàn)。

本篇主要具體介紹細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)和體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)兩種體外試驗(yàn)，以及體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)和體內(nèi)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)。

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

OECD 471給出的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，經(jīng)修改適用于醫(yī)療器械。在評(píng)估醫(yī)療器械的遺傳毒性潛力時(shí)，可以使用醫(yī)療器械材料、浸提液或提取及蒸發(fā)的殘留物

細(xì)菌選擇：使用指數(shù)生長(zhǎng)晚期或穩(wěn)定生長(zhǎng)期早期的細(xì)菌培養(yǎng)物（約109個(gè)細(xì)胞/mL），培養(yǎng)溫度為37℃，推薦的菌株有鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1535，TA1537，TA97，TA97a，TA98和TA100，大腸桿菌WP2uvrA，WP2uvrA（pKM10l）。

樣品的準(zhǔn)備：可溶解或懸浮在溶劑中的醫(yī)療器械或材料可直接用于測(cè)試；不溶于溶劑的醫(yī)療器械或材料可用浸提液作為受試樣品，受試浸提液應(yīng)在制備后的24小時(shí)內(nèi)使用。如可能，浸提液應(yīng)在制備后立即使用，以防止吸附在提取容器上或發(fā)生其他組分變化。

試驗(yàn)步驟：對(duì)于平板摻入法，在沒(méi)有代謝活化系統(tǒng)的情況下，將0.1ml的受試樣品、0.1ml的新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物（含有至少108個(gè)活細(xì)胞）和0.5ml無(wú)菌緩沖液與2.0ml頂層瓊脂混合。

對(duì)于有代謝活化系統(tǒng)的試驗(yàn)，將0.5ml含有足量線粒體后組分（體積分?jǐn)?shù)為代謝活化混合物的5%至10%）的代謝活化混合物與細(xì)菌和受試樣品/受試溶液一起與頂層瓊脂混合（2.0 ml）。將每個(gè)管中的內(nèi)容物混合并傾倒在最低營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板的表面，待頂層瓊脂凝固后再進(jìn)行孵育。37℃孵育48h-72h。結(jié)束孵育后對(duì)每個(gè)平板中的回復(fù)突變菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀應(yīng)采用一系列真實(shí)的手工計(jì)數(shù)平板進(jìn)行校準(zhǔn)，這些平板須涵蓋一定范圍的突變菌落，包括從極低到極高的數(shù)量和不同大小的菌落。數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)以每個(gè)平板的回復(fù)突變菌落數(shù)來(lái)表示。同時(shí)還應(yīng)當(dāng)給出陰性（溶劑對(duì)照和未處理對(duì)照，如果有使用）和陽(yáng)性對(duì)照平板上的回復(fù)突變菌落數(shù)。

應(yīng)當(dāng)給出受試樣品以及陽(yáng)性和陰性（未處理和/或溶劑）對(duì)照的各個(gè)平板回復(fù)突變菌落計(jì)數(shù)、平均回復(fù)突變菌落數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的陽(yáng)性結(jié)果表明該受試物能夠通過(guò)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和/或大腸桿菌基因組的堿基置換或移碼突變而誘發(fā)點(diǎn)突變。陰性結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，受試樣品不會(huì)誘發(fā)試驗(yàn)菌株的突變。 

體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)

 OECD 473給出的體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)，經(jīng)修改適用于醫(yī)療器械。在有和沒(méi)有代謝活化系統(tǒng)的情況下將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于受試樣品中，然后按照預(yù)定的時(shí)間間隔，用中期分裂相阻斷劑(如秋水仙堿)進(jìn)行處理，然后收獲、染色，并用顯微鏡分析中期分裂相細(xì)胞存在的染色體畸變。

細(xì)胞選擇：倉(cāng)鼠CHO、V79和CHL細(xì)胞系、其他哺乳動(dòng)物的外周血淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)溫度為37℃。

樣品準(zhǔn)備：可溶解或懸浮在溶劑中的醫(yī)療器械或材料可直接用于測(cè)試，不溶于溶劑的醫(yī)療器械或材料可以使用浸提液作為受試樣品。受試浸提液應(yīng)在制備后的24小時(shí)內(nèi)使用。如可能，浸提液應(yīng)在制備后立即使用，以防止吸附在提取容器上或發(fā)生其他組分變化。

試驗(yàn)步驟：在首次實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)在有和沒(méi)有代謝活化系統(tǒng)的情況下，用受試樣品對(duì)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行染毒，淋巴細(xì)胞應(yīng)在刺激有絲分裂后約48h開(kāi)始染毒。細(xì)胞暴露于受試樣品中3h-6h，并在染毒開(kāi)始后約相當(dāng)于1.5個(gè)正常細(xì)胞周期時(shí)采樣。通常用秋水仙堿處理細(xì)胞培養(yǎng)物1h至3h，收獲每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物并單獨(dú)處理以制備染色體，染色體制備包括細(xì)胞的低滲處理、固定和染色。

實(shí)驗(yàn)的單位是細(xì)胞，應(yīng)評(píng)估具有染色體結(jié)構(gòu)畸變的細(xì)胞百分比。應(yīng)列出實(shí)驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)物中不同類型的染色體結(jié)構(gòu)畸變的數(shù)量和頻率，記錄主要畸變實(shí)驗(yàn)中同期測(cè)定的所有處理培養(yǎng)物和陰性對(duì)照培養(yǎng)物的細(xì)胞毒性，提供各個(gè)培養(yǎng)物的數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)都應(yīng)以表格形式進(jìn)行匯總。

體外染色體畸變?cè)囼?yàn)的陽(yáng)性結(jié)果表明，受試樣品可誘發(fā)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)畸變。陰性結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，受試樣品不會(huì)誘發(fā)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的染色體畸變。 

問(wèn)與答

Q:進(jìn)行遺傳毒試驗(yàn)時(shí)，是否需要同時(shí)做體外和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)?

A:不需要，當(dāng)兩個(gè)體外遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性，則不需進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)；如果任意體外遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果為陽(yáng)性，則應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)誘變性試驗(yàn)。

Q:體外試驗(yàn)的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，是否需要做全部的體內(nèi)動(dòng)物毒性試驗(yàn)？

A：不需要，當(dāng)有體外毒性試驗(yàn)的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)在體外試驗(yàn)確定出的最適宜終點(diǎn)的基礎(chǔ)上選擇相應(yīng)的體內(nèi)試驗(yàn)。

Q：實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)遺傳毒性試驗(yàn)時(shí)，一般應(yīng)怎樣進(jìn)行試驗(yàn)？

A：實(shí)驗(yàn)室一般先做細(xì)菌回復(fù)試驗(yàn)和體外細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，或者細(xì)菌回復(fù)試驗(yàn)和基因突變?cè)囼?yàn)，如果兩組試驗(yàn)中出現(xiàn)任意試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，再進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)：哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)。

體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)

OECD 475給出的小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)，即體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)，包括檢測(cè)大克隆和小克隆，經(jīng)修改后適用于醫(yī)療器械。胸苷激酶（TK）豐富的細(xì)胞對(duì)嘧啶類似物三氟胸苷(TFT)敏感，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝受到抑制并停止進(jìn)一步的細(xì)胞分裂。突變細(xì)胞能夠在TFT存在的情況下增殖，而含有胸苷激酶的正常細(xì)胞則不能。

細(xì)胞選擇：試驗(yàn)中使用的是小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y TK+/-的亞克隆細(xì)胞，應(yīng)得到目標(biāo)細(xì)胞系且有足夠的細(xì)胞性能，檢查細(xì)胞是否有支原體污染，如果細(xì)胞被污染，則不應(yīng)使用。培養(yǎng)基的滲透壓和pH值應(yīng)在生理范圍內(nèi)。

可溶解或懸浮在溶劑中的醫(yī)療器械或材料可直接用于測(cè)試。不溶于溶劑的醫(yī)療器械或材料可以使用浸提液作為受試樣品，提取方法的選擇取決于從受試樣品中獲得的可提取物的百分比。

試驗(yàn)步驟：確定每種受試培養(yǎng)物和對(duì)照培養(yǎng)物的細(xì)胞毒性，在采用軟瓊脂法進(jìn)行小鼠淋巴瘤試驗(yàn)（MLA）時(shí)，使用相對(duì)總生長(zhǎng)率（RTG）來(lái)進(jìn)行測(cè)定。采用微孔檢測(cè)方法時(shí)，使用相對(duì)存活率（RS）作為細(xì)胞毒性指標(biāo)時(shí)。無(wú)論使用何種試驗(yàn)方法，均應(yīng)使用相同的細(xì)胞毒性測(cè)量指標(biāo)

在染毒期結(jié)束時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌和培養(yǎng)，以測(cè)定存活率。通常在處理期之后開(kāi)始通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物的相對(duì)存活率（RS）或相對(duì)總生長(zhǎng)率（RTG）來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒性。在軟瓊脂法中，突變頻率（MF）是通過(guò)計(jì)數(shù)TFT抗性集落的數(shù)量并對(duì)選擇性培養(yǎng)基中的接種細(xì)胞數(shù)用平板接種效率（PE）進(jìn)行校正后確定的，即MF＝（突變體數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)）×PE。對(duì)于微孔法，使用泊松分布計(jì)算平板接種效率（PE）和突變頻率（MF），然后計(jì)算突變頻率：MF = [PE（突變）/ PE（生存）] x 106。

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)的陽(yáng)性結(jié)果表明，該受試樣品可誘發(fā)所用的培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因突變，具有可重復(fù)的正向濃度-反應(yīng)關(guān)系是最有意義的。陰性結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，受試樣品不會(huì)誘發(fā)所用的培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因突變。 

體內(nèi)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

體內(nèi)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)適用于采用OECD474進(jìn)行檢測(cè)的醫(yī)療器械，通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩绞箘?dòng)物暴露于受試樣品中；如果使用骨髓，則在染毒后的適當(dāng)時(shí)間處死動(dòng)物，提取骨髓，并制備涂片（玻片）并染色。當(dāng)使用外周血時(shí)，則在染毒后的適當(dāng)時(shí)間收集血液，并進(jìn)行涂片制備和染色。對(duì)于采用外周血進(jìn)行的研究，最后一次染毒與細(xì)胞收獲之間的間隔時(shí)間應(yīng)盡可能短，分析制片中存在的微核。

動(dòng)物選擇：如果使用骨髓，建議使用小鼠或大鼠，也可以用其他合適的哺乳動(dòng)物。當(dāng)使用外周血時(shí)，建議使用小鼠；健康的初成年動(dòng)物被隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組。

試驗(yàn)步驟：根據(jù)合適的染毒方案進(jìn)行染毒，生理鹽水可以靜脈內(nèi)注射，小鼠最高20 ml/kg，大鼠最高10 ml/kg；有機(jī)溶媒或提取物可采用腹腔注射，小鼠的劑量可以是20 ml/kg，大鼠可以是10 ml/kg。

對(duì)于骨髓和外周血，采用鏡檢方法，每只動(dòng)物至少計(jì)數(shù)2000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（RET）或網(wǎng)狀紅細(xì)胞（RET），以計(jì)算有微核的嗜多染紅細(xì)胞（MN-PCE）/網(wǎng)織紅細(xì)胞（MN-RET）的發(fā)生率。

對(duì)于外周血，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，對(duì)每只動(dòng)物計(jì)數(shù)約20000個(gè)網(wǎng)織紅細(xì)胞（不成熟紅細(xì)胞）。通過(guò)對(duì)存在微核的正染紅細(xì)胞（NCE）（MN-NCE）進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以獲得其他信息。

每只動(dòng)物的骨髓數(shù)據(jù)應(yīng)以表格形式列出，實(shí)驗(yàn)單元是動(dòng)物，對(duì)于每只雄性和雌性動(dòng)物，應(yīng)記錄以下數(shù)據(jù)：嗜多染紅細(xì)胞的數(shù)量、正染紅細(xì)胞的數(shù)量以及有微核的嗜多染紅細(xì)胞和有微核的正染紅細(xì)胞的數(shù)量。應(yīng)對(duì)每只動(dòng)物計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的比例（PCE/EC比值）。匯總表應(yīng)顯示每個(gè)處理組在每個(gè)采樣時(shí)間的有微核的嗜多染紅細(xì)胞的組發(fā)生率、有微核的嗜多染紅細(xì)胞的平均發(fā)生率以及嗜多染紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的比例。

受試樣品中有微核的嗜多染紅細(xì)胞的發(fā)生頻率增加，則出于質(zhì)量控制目的，可以對(duì)有微核的正染紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)槿魏谓o定玻片中的偽象會(huì)使正染紅細(xì)胞和嗜多染紅細(xì)胞的“微核”發(fā)生率都明顯增加，也可以將有微核的正染紅細(xì)胞的平均發(fā)生率制成表格。

陰性結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，受試樣品不會(huì)引起受試動(dòng)物的不成熟紅細(xì)胞產(chǎn)生微核。

如果不符合陽(yáng)性或陰性遺傳毒性反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果可被判定為模棱兩可或不確定，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，并且最好采用調(diào)整過(guò)的實(shí)驗(yàn)條件?？梢詮拿恐惶幚韯?dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中獲得額外的PCE（+2000）計(jì)數(shù)結(jié)果，以確證結(jié)果。 

問(wèn)與答

Q：進(jìn)行遺傳毒試驗(yàn)時(shí)，是否需要同時(shí)做體外和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)?

A:不需要，當(dāng)兩個(gè)體外遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性，則不需進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)；如果任意體外遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果為陽(yáng)性，則應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)誘變性試驗(yàn)。

Q:體外試驗(yàn)的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，是否需要做全部的體內(nèi)動(dòng)物毒性試驗(yàn)？

A：不需要，當(dāng)有體外毒性試驗(yàn)的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)在體外試驗(yàn)確定出的最適宜終點(diǎn)的基礎(chǔ)上選擇相應(yīng)的體內(nèi)試驗(yàn)。

Q：實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)遺傳毒性試驗(yàn)時(shí)，一般應(yīng)怎樣進(jìn)行試驗(yàn)？

A：實(shí)驗(yàn)室一般先做細(xì)菌回復(fù)試驗(yàn)和體外細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，或者細(xì)菌回復(fù)試驗(yàn)和基因突變?cè)囼?yàn)，如果兩組試驗(yàn)中出現(xiàn)任意試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，再進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)：哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)。