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1、靈敏度的測(cè)試方法

HPLC的靈敏度可定義為：一、定量的物質(zhì)，通過(guò)HPLC的檢測(cè)器時(shí)，儀器所給出的信號(hào)大小就叫做該HPLC的靈敏度，有時(shí)也稱為響應(yīng)值。對(duì)使用者來(lái)講，總是希望HPLC儀器有較高的靈敏度，因?yàn)殪`敏度高，就意味著對(duì)等量的同一樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，儀器有較大的輸出信號(hào)。但是，靈敏度的高低，并不能表示HPLC儀器的檢測(cè)能力。只有檢出限，才能表示儀器的最大檢測(cè)能力。

HPLC靈敏度的測(cè)試方法：主要根據(jù)信噪比的定義進(jìn)行測(cè)試。一般取信號(hào)等于或大于噪聲2倍時(shí)的檢測(cè)量或濃度(信號(hào)強(qiáng)度)作為HPLC的信號(hào)大小。信號(hào)與噪聲二者相除即為儀器的信噪比(靈敏度，但是要求S/N≧2)。

2、檢測(cè)限測(cè)試方法

講HPLC的指標(biāo)、給出HPLC的譜圖，應(yīng)該實(shí)事求是的給出使用的靈敏度量程(一般使用最靈敏量程)，給出樣品濃度(一般是噪聲的3倍左右)，才能說(shuō)明儀器的檢測(cè)限或靈敏度。

3、光學(xué)類檢測(cè)器噪聲的測(cè)試方法

HPLC的噪聲是一種與被測(cè)樣品無(wú)關(guān)的、隨機(jī)輸出的信號(hào)。國(guó)際上對(duì)噪聲的定義、測(cè)試方法各異。例如：美國(guó)材料協(xié)會(huì)制訂的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)(ASTM)，規(guī)定噪聲分為長(zhǎng)噪聲、短噪聲、和超短噪聲三種。長(zhǎng)噪聲是指每小時(shí)內(nèi)有6個(gè)至60個(gè)變化周期的噪聲，所以，測(cè)定時(shí)間至少應(yīng)該測(cè)試一小時(shí);短噪聲是指每小時(shí)內(nèi)有1個(gè)至10個(gè)變化周期的噪聲，所以，測(cè)定時(shí)間至少應(yīng)該測(cè)試10分鐘至60分鐘內(nèi);超短噪聲是指每分鐘內(nèi)有10個(gè)以上的變化周期的噪聲，所以，測(cè)定時(shí)間應(yīng)該大于1分鐘。

從使用者的角度看，噪聲又分為靜態(tài)噪聲和動(dòng)態(tài)噪聲。其測(cè)試方法如下：

1)靜態(tài)噪聲測(cè)試：冷態(tài)開機(jī)(關(guān)機(jī)2小時(shí)后開機(jī))，預(yù)熱30分鐘，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)。在這1小時(shí)里，任取10分鐘(包含最差的峰-峰值)，在這10分鐘里取峰對(duì)峰值(P-T0-P)的最大值，就是儀器的噪聲。但是，10分鐘里的峰對(duì)峰(P-T0-P)值，不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值，即：“10分鐘里的峰對(duì)峰”值，不等于瞬時(shí)的峰-峰(P-P)值，測(cè)試數(shù)據(jù)前面應(yīng)加“±”符號(hào)。

注意：開機(jī)30分鐘后，儀器調(diào)整到最靈敏度檔(如：對(duì)量程為0.005-3.0AUFS的儀器，取0.005AUFS，即縱坐標(biāo)設(shè)置為0.005A);設(shè)置波長(zhǎng)λ=250nm(有人設(shè)置500 nm，但最好測(cè)試250 nm);設(shè)置0 Abs(即時(shí)間掃描，吸光度從0點(diǎn)開始測(cè)試);光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不需選擇)。

在上述條件下，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)(用儀器上的CRT指示輸出，或用數(shù)字電壓表監(jiān)測(cè))。在1小時(shí)內(nèi)，任取10分鐘的峰對(duì)峰值(P-T0-P)，其最大者前面加“±”符號(hào)，即是儀器的噪聲。目前，國(guó)際上大多數(shù)科技工作者，基本上采用這種方法測(cè)試HPLC儀器的靜態(tài)噪聲。

有些科技工作者，認(rèn)為在10分鐘的峰對(duì)峰值(P-T0-P)前如果要加“±”符號(hào)，就應(yīng)對(duì)峰-峰值的絕對(duì)值先除“2”。這種做法是不妥的，會(huì)低估儀器的噪聲。因?yàn)樵肼暿请S機(jī)的，可能是“+”值也可以是“-”值。

上述儀器條件的設(shè)置，在有些儀器上是不需要的，因?yàn)橛捎谟?jì)算機(jī)的發(fā)展和普遍應(yīng)用，很多儀器的坐標(biāo)設(shè)置，完全由儀器的計(jì)算機(jī)自動(dòng)設(shè)置。

2)動(dòng)態(tài)噪聲測(cè)試：

作者在研發(fā)檢測(cè)器和使用HPLC時(shí)所采用的測(cè)試動(dòng)態(tài)噪聲方法如下：連接恒流泵、液相色譜分離柱和檢測(cè)器。在恒流泵和檢測(cè)器中有移動(dòng)相(流動(dòng)相)流動(dòng)。

具體操作方法如下：

冷態(tài)開機(jī)，預(yù)熱30分鐘，設(shè)恒流泵的流速1mL/min;檢測(cè)器設(shè)置：儀器調(diào)整到最靈敏度檔(如：0.005AUFS;即縱坐標(biāo)設(shè)置為0.005AU);波長(zhǎng)λ=250nm(有人設(shè)置500 nm，但最好測(cè)試250 nm)、0 Abs(即時(shí)間掃描，吸光度和時(shí)間都從0點(diǎn)開始測(cè)試)，光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不能選擇)，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)，可以用儀器上的CRT指示噪聲在這1小時(shí)里，任取10分鐘(包含最差的峰-峰值)，在這10分鐘里取峰對(duì)峰值(P-T0-P)的最大值，就是儀器的噪聲。但是，10分鐘里的峰對(duì)峰(P-T0-P)值，不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值，即：“10分鐘里的峰對(duì)峰”值，不等于瞬時(shí)的峰-峰(P-P)值。測(cè)試數(shù)據(jù)前面應(yīng)加“±”符號(hào)。目前，國(guó)際上基本上采用這種方法測(cè)試HPLC儀器的動(dòng)態(tài)噪聲。有時(shí)候，為了節(jié)省時(shí)間，也可以在漂移測(cè)試的基礎(chǔ)上檢測(cè)噪聲。但是開機(jī)時(shí)間就不是30分鐘，而是2小時(shí)。這樣所得測(cè)試數(shù)據(jù)稍小于開機(jī)30分鐘的數(shù)據(jù)(因此，給出數(shù)據(jù)時(shí)要說(shuō)明方法)，數(shù)據(jù)處理方法仍如上所述。

3)目前國(guó)內(nèi)外的HPLC制造商，往往在儀器樣本上給出的都是檢測(cè)器的靜態(tài)噪聲，同時(shí)注明了儀器的狀態(tài)(檢測(cè)器空池)。這樣做，對(duì)于使用者了解整個(gè)儀器系統(tǒng)中的檢測(cè)器性能有利，也是可以的。但是不符合使用者的總體要求，因?yàn)槭褂谜叩目傮w要求是：整個(gè)HPLC系統(tǒng)(包括泵、柱、檢測(cè)器)處在使用狀態(tài)(動(dòng)態(tài))的情況下，整機(jī)的噪聲有多大。所以，作者認(rèn)為靜態(tài)噪聲可以給出，也可以不給出，但是動(dòng)態(tài)噪聲必須給出。

注意：噪聲測(cè)試時(shí)，國(guó)際接軌的做法是在500nm。但是有些廠商卻給出700nm處測(cè)試的噪聲，這也是不對(duì)的。因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)短，能量大;500nm處的能量比700nm處大，所以在700nm處測(cè)試的噪聲，數(shù)據(jù)會(huì)偏小，數(shù)據(jù)不真實(shí)。

4)中國(guó)的HPLC國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(2011版)和計(jì)量檢定規(guī)程JJG705-2002也規(guī)定了噪聲的測(cè)試方法，但是分別都還有一些值得推敲的問(wèn)題，請(qǐng)大家自己參閱。

5)這里特別需要提出的是：目前有些國(guó)外HPLC生產(chǎn)廠商，為了吸引用戶，制造了一些違背儀器學(xué)理論的指標(biāo)。例如：國(guó)外某廠商，在招標(biāo)中給出HPLC的噪聲時(shí)，先采用計(jì)算機(jī)對(duì)噪聲進(jìn)行平滑，并且采用最大量程測(cè)試，結(jié)果給出的HPLC噪聲非常小、譜圖基線非常平直、譜峰尖而陡直，給人的印象是世界一流的HPLC。其實(shí)不然，給出的數(shù)據(jù)和譜圖都是虛假的。如果用盲樣進(jìn)行比對(duì)測(cè)試，因?yàn)樗麄兊腍PLC的噪聲大，信噪比差，靈敏度差，所以立即敗下陣來(lái)。

我國(guó)三聚氰胺國(guó)標(biāo)的建立過(guò)程中的比對(duì)測(cè)試結(jié)果就是如此，專家們從三家公司(兩家外企,一家國(guó)產(chǎn)儀器公司(普析通用公司))的三種HPLC全方位比對(duì)測(cè)試的結(jié)果(標(biāo)樣由國(guó)家標(biāo)物中心提供)中，最后選用了國(guó)產(chǎn)北京普析通用的早期HPLC產(chǎn)品L6作為國(guó)家建標(biāo)的儀器(L6是《原料乳三聚氰胺快速測(cè)定--液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用的唯一國(guó)產(chǎn)儀器)，其根本原因是L6的比對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠、噪聲小、S/N高、性價(jià)比高等等。

4、穩(wěn)定性(基線漂移和重復(fù)性)測(cè)試方法：

這里包括儀器的靜態(tài)基線漂移和動(dòng)態(tài)基線漂移的測(cè)試方法：

一般來(lái)說(shuō)，使用者不關(guān)心單個(gè)檢測(cè)器的靜態(tài)指標(biāo)，所以，可以不專門測(cè)試檢測(cè)器的靜態(tài)基線漂移。但是，作者認(rèn)為設(shè)計(jì)、制造者應(yīng)該測(cè)試靜態(tài)基線漂移這個(gè)指標(biāo)，測(cè)試方法與測(cè)試整機(jī)(系統(tǒng))的動(dòng)態(tài)基線漂移完全相同。

動(dòng)態(tài)基線漂移測(cè)試方法如下：冷態(tài)開機(jī)，預(yù)熱2小時(shí)，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)。1小時(shí)內(nèi)的最大最小值之差就是動(dòng)態(tài)漂移。(也有測(cè)試更長(zhǎng)時(shí)間的，例如作者在FLD檢測(cè)器研發(fā)時(shí)，為了考察儀器的長(zhǎng)時(shí)間漂移，連續(xù)測(cè)試48小時(shí)，儀器的漂移小于5mV)。

5、重復(fù)性及其測(cè)試方法：與漂移測(cè)試方法相同，對(duì)儀器進(jìn)行多次測(cè)試(作者認(rèn)為一般是5-7次)，其數(shù)據(jù)的符合程度就是重復(fù)性，一般用RSD表示。

6、量程范圍及其測(cè)試方法

1)定義

儀器能適用測(cè)量的范圍或儀器能滿足測(cè)量要求的范圍叫量程范圍。其表示方法為AUFS(Absorbance Unit Full Scale)或AU/FS(Absorbance Unit/Full Scale)。80年代以前，也有很多人用OD(光密度)這個(gè)概念表示Abs(Absorbance)，即用ODFS來(lái)表示UVD的量程，但是OD不符合光對(duì)物質(zhì)吸收的物理概念，不符合儀器學(xué)理論，所以，目前國(guó)際上已經(jīng)廢除“OD”概念，不能再使用“ODFS”了。

在實(shí)際的日常分析工作中，也有化學(xué)工作者用具體的化學(xué)物質(zhì)來(lái)描述HPLC的量程。但是不同物質(zhì)，由于摩爾吸光系數(shù)不同，表現(xiàn)出的靈敏度也不同，所以作者認(rèn)為用具體的化學(xué)物質(zhì)來(lái)描述HPLC的量程不符合儀器學(xué)理論的要求。作者認(rèn)為，給出AUFS最合適，其最大優(yōu)點(diǎn)是這種表示方法與樣品的性質(zhì)無(wú)關(guān)，便于比較同一類型檢測(cè)器的性能優(yōu)劣。但是這種表示方法對(duì)使用者來(lái)說(shuō)不大直觀、不大方便。目前，國(guó)際上的HPLC儀器的量程范圍一般為：0.005-2.5AUFS(例如Waters的HPLC)。少數(shù)優(yōu)質(zhì)儀器的下限為0.001AUFS,但是有些儀器給出0.001-3.0AUFS的量程是有水分的，因?yàn)閁VD的雜散光一般都比較大，而雜散光是光吸收類分析儀器主要分析誤差的來(lái)源，它主要限制被分析樣品濃度(吸光度)的上限。所以，HPLC的UVD給出0.001-3.0AUFS的量程一般是不準(zhǔn)確的。

目前，國(guó)內(nèi)外很多HPLC儀器的UVD生產(chǎn)廠商不給儀器的量程，這是不妥的。因?yàn)?，不給量程范圍就意味著不知道檢測(cè)器的靈敏度(下限)，不知道多少吸光度時(shí)儀器能達(dá)到滿度。當(dāng)然，目前有很多HPLC儀器的UVD生產(chǎn)廠商，給出了儀器對(duì)某一物質(zhì)的最小檢測(cè)濃度或最小檢測(cè)量，這在某種程度上也可以反映儀器的靈敏度，并且對(duì)使用者來(lái)說(shuō)，比較方便、比較直觀。但是，這種表示方法只是對(duì)某一物質(zhì)而言，特別是會(huì)帶來(lái)樣品處理產(chǎn)生的誤差、容易低估儀器噪聲的影響，因此，從儀器學(xué)理論的角度來(lái)看是不科學(xué)的。

2)量程范圍測(cè)試方法

目前，國(guó)際上對(duì)HPLC的UVD的量程范圍設(shè)計(jì)指標(biāo)，一般在0.005-3.0AUFS內(nèi)。作者在研制HPLC的UVD檢測(cè)器時(shí)，用原上海大華儀表廠生產(chǎn)的XWT-204記錄儀的1V檔測(cè)試。當(dāng)對(duì)數(shù)放大器的差分放大器的總輸出為1V時(shí)，記錄儀滿度(100格)。當(dāng)儀器的有效光電信號(hào)從0.005-3.0V時(shí)，均可保證對(duì)數(shù)放大器的輸出為1V;此時(shí)，這個(gè)0.005-3.0V對(duì)應(yīng)的吸光度為0.005-3.0Abs。要求從0.005-3.0Abs時(shí)，光度準(zhǔn)確度都能保證在1%以內(nèi)(即1V±10mv)。如此測(cè)量3次并取均值，即是HPLC的量程范圍(0.005-3.AUFS)。

目前，國(guó)內(nèi)外許多制造商都用萘或者蒽來(lái)測(cè)試HPLC系統(tǒng)的靈敏度，這種做法也可以，但是從儀器學(xué)理論角度考量，作者認(rèn)為不科學(xué)。因?yàn)椋孩佟⒉荒芙o出儀器的測(cè)量范圍，只能給出萘的最小檢測(cè)濃度;②、試樣的配制會(huì)帶來(lái)很多誤差;③、這種方法所作的測(cè)試，實(shí)際上是計(jì)算出來(lái)的靈敏度，而不是測(cè)試出來(lái)的真正的靈敏度，不能反應(yīng)儀器真正的靈敏度。如果實(shí)際測(cè)試，肯定比計(jì)算的數(shù)據(jù)大很多。④、不與國(guó)際接軌，不便比較不同儀器的性能。雖說(shuō)近幾年國(guó)內(nèi)外采用此方法的科技工作者比過(guò)去多，但是不能掩蓋方法的局限性。所以，最好的方法還是給出儀器的測(cè)量范圍。

還有人用靜態(tài)噪聲的2倍或3倍來(lái)計(jì)算最小檢測(cè)濃度，這樣計(jì)算出來(lái)的結(jié)果，同樣是不真實(shí)的。因?yàn)閺膬x器學(xué)理論角度來(lái)看，一般在正常情況下，最小檢測(cè)濃度是在系統(tǒng)處在動(dòng)態(tài)的情況下測(cè)試的，所以計(jì)算最小檢測(cè)濃度就必須用動(dòng)態(tài)噪聲，而不能用靜態(tài)噪聲。

還有人測(cè)試HPLC的最小檢測(cè)濃度時(shí)，采用一些計(jì)算公式(如：C_min=2NC/H×20，式中：Cmin 為最小檢測(cè)濃度，N為儀器的噪聲;C為濃度，H為峰高)，計(jì)算時(shí)不考慮移動(dòng)相的流速，這是不妥的。不考慮移動(dòng)相的流速或計(jì)算公式中去掉移動(dòng)相的流速，就意味著是靜態(tài)的最小檢測(cè)濃度，而使用者需要的是系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)最小檢測(cè)濃度。所以作者認(rèn)為這種計(jì)算方法很不合理，對(duì)使用者來(lái)講是沒有意義的，這種計(jì)算方法不可采用。