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嘉峪檢測網(wǎng) 2019-12-03 15:43
從藥物研制到開發(fā)、制造和QA/QC，分析型的液相色譜在藥物的整個生命周期中發(fā)揮著重要作用，使得使用者能夠迅速進行篩選、純化的分析工作?，F(xiàn)在市面上廣泛使用的分析型高效液相色譜主要包括：流動相模塊，在線脫氣模塊，動力模塊（泵），進樣模塊，柱溫箱模塊，檢測器模塊等。以下我們將詳細討論其中流動相模塊、動力模塊、自動進樣器模塊、柱溫箱模塊的使用注意事項，而這些模塊往往也是影響檢測結(jié)果的重要模塊，打算將在實驗室中平時總結(jié)的注意事項加以交流。
高效液相色譜模塊示意圖
1、流動相模塊
流動相就如同人體的血液，其質(zhì)量直接影響到整個系統(tǒng)的正常運行與否。在日常使用中避免使用可腐蝕鋼的溶劑：堿金屬鹵化物及其酸溶液(如：碘化鋰、氯化鉀等)；高濃度無機酸，如硝酸、硫酸；可能含有過氧化物的色譜純醚(如THF、二氧六環(huán)、二丙基乙醚)，這些在使用前利用干燥氧化鋁的穩(wěn)定性來鈍化處理過氧化物，在過氧化物外面形成一個包裹層；四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液，它們不但容易形成過氧化物而且它們會腐蝕一些Peek（聚醚醚酮材料，Polyetherketone）材料的液相色譜配件。流動相可以使用超純水、磷酸、磷酸二氫鉀、三乙胺、離子對試劑、正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、甲酸胺、乙酸、乙酸胺、丙酮、異丙醇、氨水等。
流動相中的過濾器
在每瓶流動相中配有過濾器，應定期檢查溶劑過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)，定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，每三個月至少清洗一次。對于以下幾點流動相部分的注意事項更是在每次使用都應當注意的。
應該使用HPLC級的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換。一般在水相和與其不能混溶的溶劑切換時，使用異丙醇作為過渡溶劑。
注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的最低波長,低于該波長后,溶劑會有很強的紫外吸收，從而影響基線的穩(wěn)定性、干擾對所分析物質(zhì)的檢測。
HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾過的(RRLC則必須使用0.2μm濾膜過濾)。建議每天更換新鮮的水。長期不用時，必須把使用水的管路用有機溶劑置換，防止長霉。
儀器使用完后要采用適當?shù)娜軇_洗等方法維護色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。
儀器長期不用時，最好不要使用純乙腈封存。因為乙腈有生成聚合物的趨勢。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。
2、動力（泵）模塊
高效液相色譜儀一般是采用四元泵或者二元泵。四元泵在常壓下將兩種（或多元溶劑）輸至混合器中混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中。因溶劑混合在低壓下進行，故稱低壓混合系統(tǒng)。二元泵用兩個高壓輸液泵將兩種溶劑輸入混合器，進行混合后再進入色譜柱。因溶劑混合在高壓下進行，故稱高壓混合系統(tǒng)。Waters公司的Alliance系列的采用的是四元低壓混合梯度泵（帶在線真空脫氣機），作為其主流產(chǎn)品。當然Waters公司保留了二元高壓混合梯度泵Brezee系列，作為普及型的產(chǎn)品。 島津公司推出的LC-2010系列只有四元低壓混合梯度泵一種泵型。安捷倫公司的1100系列將在線脫空氣機和四元低壓混合梯度泵結(jié)合，解決了氣泡問題。以下是關(guān)于高效液相泵模塊的常見注意事項：
四元泵的工作示意圖
二元泵的工作示意圖
將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面(或較高處)當在四元泵上使用鹽溶液或有機溶劑時，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上，將有機溶劑接在上面的梯度閥口上。
用水定期沖洗除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶。
操作泵之前，用至少兩個體積(標準脫氣機30mL，對微脫氣機10mL)沖洗真
空脫氣機，特別是當泵關(guān)閉了一段時間后(例如，過夜)，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時。
當使用低流速時（不高于0.2ml/min），檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏（用壓力測試或漏液測試）。
更換活塞密封墊時檢查活塞桿上是否有劃痕，有劃痕的活塞將導致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命，所以要盡早更換有劃痕的活塞。
使用緩沖溶液時，關(guān)泵前要先用水沖洗系統(tǒng)。當需要長時間使用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時，最好選用密封墊清洗附件以減少對密封墊及活塞桿的磨損。
如果使用了高濃度的緩沖鹽，可以用熱水（50－60℃）來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。
當泵頭安裝有柱塞清洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力。所以開泵前一定要用10％異丙醇，并將其流速調(diào)至約2－3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。10％異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。
泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度。
3、自動進樣器模塊
不同品牌和型號的高效液相色譜的自動進樣器模塊有一定的差別。在這里我們介紹幾個經(jīng)典的自動進樣器模塊及其使用注意事項：
安捷倫1260 Infinity液相色譜儀的自動進樣器模塊如下圖所示，其注意事項主要是：
樣品在進樣前必須經(jīng)過適當?shù)念A先處理，需要經(jīng)過亞微米濾膜的過濾或者離心，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路。
最好使用流動相作為溶劑配制樣品，所用溶劑應該對樣品有較好的溶解性。所分析樣品在流動相中溶解性不太好時，使用強溶劑溶劑樣品容易造成峰形很差的前伸峰。
針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時空氣中的較大灰塵顆?？赡芮『寐湓卺樧牧髀穬?nèi)而引起針座的堵塞。這時候可以嘗試卸下針座，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題。
ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋；使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會引起ALS故障率的增加及性能的降低。
如果有自動進樣器的保溫模塊，注意冷凝水的管線要保持通暢，并且不要處于廢液瓶液面以下。
自動進樣器與恒溫模塊后的控制線，一定要在拔掉電源線后，才可以安裝或者移除。
對于賽默飛WPS-3000 Auto sampler(SL)：
當使用專用清洗液瓶時，應在每次開機前將瓶中的溶劑換成脫氣的溶劑，并注意檢查量是否充足。
使用溶劑通道液體作為清洗液時，應在泵內(nèi)置脫氣機完成流動相脫氣及泵排氣泡后執(zhí)行相應的操作，以免引入氣體。
樣品瓶、多孔板及樣品托盤重新放置后，應對其放置是否正確進行確認，以免造成進樣針的損壞。
在使用非標準樣品容器或襯管時，應注意測量瓶底的高度和寬度并對進樣針插入高度進行相應的修改。
對于島津SIL-20A自動進樣器，進樣針不容易扎進去進樣不平行，這個可以換預開口的隔墊解決。普通的SIL-20A只能耐壓20MPa，在使用時注意不要超過壓力限。
4、柱溫箱模塊
使用液相色譜進行分析時，柱溫箱對實驗分析的穩(wěn)定性高、靈敏度、重現(xiàn)性作出了重要的貢獻。柱溫箱主要作用在于使柱子的溫度保持一定，按照溫度調(diào)節(jié)方式大致分為：空氣循環(huán)式、水夾套式以及模塊加熱式。液相色譜法支配分離的的方式有：分配、吸附、離子交換、尺寸排除，這些平衡依賴于溫度，通過柱溫箱維持柱溫，似的在試樣的分離，選擇性以及保留時間上得到良好的重現(xiàn)性。另外由于溫度越高，目標成分與固定相的平衡變快，柱效將增長，分離也會有所改善。另外柱溫箱有助于穩(wěn)定電信號，減少信號波動，也有利于降低液體的粘度從而降低柱壓。以下是關(guān)于高效液相柱溫箱模塊的常見注意事項：
連接的管路要盡量短，防止熱擴散及峰增寬。
如果使用小體積分析柱以及流速小于0.2mL/min時建議使用左邊的柱溫箱(左邊體積較少,3uL；右邊為6uL)，也可使用低擴散組件。
除非特殊應用，建議將兩邊溫度設(shè)置一樣。
在使用冷卻功能時，要防止因冷凝水而觸發(fā)漏液傳感器。
一般分析柱接到左邊3μL內(nèi)體積的加熱塊上，半制備柱可以接在右邊6μL內(nèi)體積的加熱塊上。如果必要，如做GPC（Gel Permeation Chromatography，凝膠滲透色譜分析）等對穩(wěn)定要求高的分析時，可以將兩個加熱塊串接，得到更好的溫度穩(wěn)定性。
在實驗過程中要關(guān)好前蓋。
換柱的時候，注意螺絲一定要注意，先用手旋緊后，再用扳手旋緊。
參考文獻
1.YinH, Killeen K. The fundamental aspects and applications of Agilent HPLC‐Chip[J].Journal of separation science, 2007, 30(10): 1427-1434.
2. McMasterM C, HPLC A. A Practical User’s Guide [M]. VCH, New York, 1994.
3.SnyderL R, Kirkland J J, Glajch J L. Practical HPLC method development[M]. John Wiley& Sons, 2012.
4. 島津SIL-20A/AC用戶手冊
5. 安捷倫1260G1329-97015用戶手冊
6. 賽默飛WPS-3000用戶手冊
7. 日立Primaide1210自動進樣器說明
來源：藥事縱橫
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