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嘉峪檢測網(wǎng) 2019-12-18 17:55
摘要
2020版0512高效液相色譜法新增內(nèi)容較多，本文對其進(jìn)行匯總整理，并與USP、EP相關(guān)收錄內(nèi)容進(jìn)行對比，以期了解其內(nèi)涵，在日常工作中更好的運(yùn)用，解決實(shí)際問題。不足與錯(cuò)誤之處望同行批評指正。
一、對儀器的一般要求和色譜條件—新增電噴霧檢測器
1.1測定原理：基于霧化檢測器的原理，洗脫液經(jīng)霧化后形成顆粒，經(jīng)過蒸發(fā)管干燥后與帶電氮?dú)馀鲎?，使得分析物顆粒表面帶上正電荷，最后通過靜電計(jì)測量分析物顆粒表面的電荷量。CAD的定量基礎(chǔ)為峰面積與分析物顆粒表面所帶電荷量相關(guān)，分析物顆粒表面電荷量與分析物質(zhì)量相關(guān)。
1.2 檢測器示意圖：示意圖如下，柱子的洗脫液被霧化，流動相也被蒸發(fā)，類似于ELSD或MS檢測器，氣化的分析物與氮?dú)饬骰旌希ǖ獨(dú)饬饕驯浑姇炨樂烹娧b置帶上了正電荷），電荷隨之轉(zhuǎn)移到分析物顆粒上，為了提高信號的質(zhì)量，流動相中較大的物質(zhì)在離子阱中被除去。剩余的帶電分析物離子被靜電檢測器檢測到。
CAD對揮發(fā)性比流動相小的化合物都有足夠的靈敏度，流動相中不能含有不揮發(fā)性的鹽類。
1.3適用范圍：適用于紫外吸收較弱或無紫外吸收雜質(zhì)的檢測，可作為RI或ELSD代替的檢測器測定糖類或其它碳水化合物。（本節(jié)摘自藥事縱橫分析方法開發(fā)-檢測器的選擇）
二、對儀器的一般要求和色譜條件—新增分析方法允許的調(diào)整范圍
2.1、調(diào)整范圍
分析方法在其使用周期里極有可能發(fā)生變更或調(diào)整。例如，如果方法不再滿足性能要求，就可能要求改變方法參數(shù)以達(dá)到最初制定的性能指標(biāo)。那么何時(shí)要對方法進(jìn)行重新驗(yàn)證以及如何將其形成文件。
驗(yàn)證過的分析方法常常不能達(dá)到預(yù)期的效果。比如，液相色譜峰達(dá)不到方法規(guī)定的分離度?？赡艿脑蛴校?/span>
1. 方法由研發(fā)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到常規(guī)實(shí)驗(yàn)室，或在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
2. 把法定方法或標(biāo)準(zhǔn)方法引入實(shí)驗(yàn)室。
3. 使用了相同或不同廠家不同型號的儀器，其性能參數(shù)不同，比如不同 HPLC 的延遲體積不同。
4. 使用時(shí)間久了，色譜柱性能發(fā)生改變。
5. 新批號的色譜柱性能不同。
6. 引進(jìn)新技術(shù)優(yōu)化分析，例如，節(jié)約運(yùn)行成本，減小色譜柱內(nèi)徑以節(jié)約流動相，或減小粒徑以節(jié)約分析時(shí)間。
通常分析人員會嘗試改變一些方法參數(shù)，如流動相組成、柱溫或流速，以使方法性能達(dá)到原來的技術(shù)指標(biāo)。但分析人員對這類改變以后是否需要重新驗(yàn)證方法不甚清楚。
在歐洲藥典EP9.0、美國藥典USP40-NF35的色譜法通則及2020版《中國藥典》通則0512征求意見中可以找到這個(gè)問題的答案。這些通則中列出了液相色譜和氣相色譜中的一些性能參數(shù)，只要符合系統(tǒng)適用性的要求，這些參數(shù)即使改變也無需重新驗(yàn)證，各國藥典相關(guān)要求如下表所示：
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高效液相色譜法 |
USP |
EP |
Chp2020 |
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固定相 |
/ |
/ |
不得改變固定相的理化性質(zhì)，如填料材質(zhì)，表面修飾及 鍵合相均需保持一致；從全多孔填料到表面多孔填料的 改變，在滿足上述條件的前提下是被允許的 |
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色譜柱長度 |
±70% |
±70% |
改變色譜柱粒徑和柱長后，L/dp 值(或 N 值)應(yīng)在原有數(shù)值 的-25%～+50%范圍內(nèi) |
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內(nèi)徑 |
可調(diào)整，但線速度不變 |
±25% |
/ |
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粒徑 |
可以減小50%，不能增加 |
可以減小50%，不能增加 |
同柱長要求 |
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流速 |
±50%，線速度不變，調(diào)整幅度可以更高 |
±50% |
F2=F1×[(dc2 2×dp1)/(dc1 2×dp2)]，在此基礎(chǔ)上可以根據(jù)實(shí)際 使用時(shí)系統(tǒng)壓力和保留時(shí)間，允許流速在±50%的范圍內(nèi) 進(jìn)行調(diào)整 |
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柱溫 |
±10 ℃ |
±10% |
當(dāng)溫度有規(guī)定時(shí)，可在±10℃范圍內(nèi)調(diào)整 |
|
進(jìn)樣量 |
可以減?。?span style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">LOD和重復(fù)性沒問題） |
可以減?。?span style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">LOD和重復(fù)性沒問題） |
Vinj2=Vinj1×(L2×dc2 2)/(L1×dc1 2)，并根據(jù)靈敏度的需求進(jìn)行 調(diào)整。即便沒有對色譜柱尺寸進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)樣體積也可調(diào)整以滿 足系統(tǒng)適用性的要求 |
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pH |
±0.2 |
±0.2（中性物質(zhì)±1） |
除另有規(guī)定外，流動相中水相 pH 值可在±0.2pH 范圍內(nèi)進(jìn) 行調(diào)整 |
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UV波長 |
不允許調(diào)整 |
不允許調(diào)整 |
不允許改變 |
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緩沖液中鹽濃度 |
±10% |
±10% |
可在±10%范圍內(nèi)調(diào)整 |
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流動相組成 |
少量組分（<50%）相對變化量±30%或絕對變化量為±10%，取二者較小者 |
少量組分相對變化量±30%或絕對變化量為±2%，取二者較小者 |
等度洗脫流動相比例：最小比例的流動相組分可在相對值±30%或者絕對值±2% 的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整（兩者之間選擇最大值）；最小比例流動 相組分的比例需小于（100/n）%，n 為流動相中組分的個(gè) 數(shù) 梯度洗脫程序：tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc2 2)/(L1×dc1 2)]，保持不同規(guī)格色譜 柱的洗脫體積倍數(shù)相同，從而保證梯度變化相同，并需要 考慮不同儀器系統(tǒng)體積的差異 |
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氣相色譜法 |
USP |
EP |
Chp2020 |
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色譜柱長度 |
±70% |
±70% |
不涉及 |
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色譜柱內(nèi)徑 |
±50% |
±50% |
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粒徑 |
允許變化必須通過系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) |
-50%，不得增大 |
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液膜厚度 |
-50~100% |
-50~100% |
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流速 |
±50% |
±50% |
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柱溫 |
±10 % |
±10 % |
|
|
進(jìn)樣量 |
可以減?。ㄈ绻?span style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">LOD和重復(fù)性沒問題） |
可以減小（如果LOD和重復(fù)性沒問題） |
Chp相關(guān)備注：F1：原方法中的流速 F2：調(diào)整后方法中的流速 dc1：原方法中色譜柱的內(nèi)徑dc2：調(diào)整后方法中色譜柱的內(nèi)徑 dp1：原方法中色譜柱的粒徑 dp2：調(diào)整后方法中色譜柱的粒徑；Vinj1：原方法中進(jìn)樣體積；Vinj2：調(diào)整后方法中進(jìn)樣體積；L1：原方法中色譜柱柱長 L2：調(diào)整后方法中色譜柱柱長 tG1：原方法的梯度段洗脫時(shí)間 tG2：調(diào)整后的梯度段洗脫時(shí)間，可通過相關(guān)軟件計(jì)算表 1 中流速、進(jìn)樣體積和梯度洗脫程序的調(diào)整范圍，并根據(jù)色譜峰分離情況進(jìn)行微調(diào)。若調(diào)整超出上表中規(guī)定的范圍，調(diào)整的方法應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證。
以上給定的限度范圍不得理解為任何方法都可以在所有性能參數(shù)的限度范圍內(nèi)任意改變。USP和EP要求在任何變更之后進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。如果能夠達(dá)到系統(tǒng)適用性的標(biāo)準(zhǔn)，則不要求進(jìn)行重新驗(yàn)證。換句話說，應(yīng)對方法的性能進(jìn)行證實(shí)，但不需要重新驗(yàn)證。基點(diǎn)應(yīng)該是前一次重新驗(yàn)證的參數(shù)，而不是方法發(fā)生變更的前一次參數(shù)。例如， 如果最初驗(yàn)證的流速是1.0ml/min，第一次變?yōu)?/span>1.4（40%），接著又 變成1.7（從前一次變化算是20%，而按基點(diǎn)計(jì)算應(yīng)是70%），這時(shí)， 即使能夠通過系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，也要重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。下圖給出了色譜法需要變更時(shí)可以遵循的流程圖。
2.2、方法調(diào)整與方法驗(yàn)證中耐用性的關(guān)系
液相色譜法中的典型影響耐用性的變動因素
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可變參數(shù) |
允許變化范圍 |
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分離檢測系統(tǒng)典型變量 |
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流動相的pH值（HPLC） |
用于流動相制備的緩沖溶液的pH能夠在±0.2或指定的范圍內(nèi)調(diào)整。 |
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流動相的組成 |
用于流動相中有機(jī)相的比例調(diào)整，通常情況是在±5%的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。 |
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緩沖液中鹽的濃度（HPLC） |
用于制備流動相的緩沖溶液的鹽的濃度能在±10%的范圍內(nèi)調(diào)整，且允許的變動符合上述要求。 |
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紫外檢測器波長（HPLC） |
方法中偏離指定波長是不被允許的，檢測器供應(yīng)商指定的程序或其他程序可以被用于確認(rèn)檢測器波長的誤差最大不能超過±3 nm。 |
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柱溫（HPLC） |
能被在±10%范圍內(nèi)調(diào)整。為了提高保留時(shí)間的可控性和重現(xiàn)性推薦使用柱溫箱。 |
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其它項(xiàng) |
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供試品的穩(wěn)定性、樣品的提取效率、濾膜吸附、方法的重現(xiàn)性等 |
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由上述內(nèi)容可知，方法驗(yàn)證中的耐用性與方法可調(diào)整范圍的異同點(diǎn)如下：
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不同點(diǎn) |
方法的耐用性 |
方法的可調(diào)整范圍 |
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目的 |
評估方法的耐受性 |
當(dāng)方法無法滿足測定要求時(shí)，確定允許方法調(diào)整的范圍 |
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適用范圍 |
所用涉及驗(yàn)證的方法，均需進(jìn)行該項(xiàng) |
方法轉(zhuǎn)移過程、更換不同型號檢測儀器、引進(jìn)新檢測技術(shù)等 |
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相同點(diǎn) |
方法的耐用性 |
方法的可調(diào)整范圍 |
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評價(jià)指標(biāo) |
采用系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)及樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評估 |
同耐用性評價(jià)指標(biāo) |
2.3、重新驗(yàn)證
下列情況要求重新進(jìn)行方法驗(yàn)證：
1) 為達(dá)到最初的性能要求而變更方法，且該變更超出了相關(guān)指導(dǎo)原則的容許范圍
2) 分析的新化合物不在方法的原定范圍內(nèi)
3) 樣品基質(zhì)發(fā)生改變
發(fā)生任何這類變更時(shí)，均應(yīng)按變更控制程序要求將其形成文件，并對方法進(jìn)行重新驗(yàn)證。變更控制程序應(yīng)要求明確變更原因。變更應(yīng)得到授權(quán)并制成文件后方可實(shí)施。應(yīng)證明性能測試的合理性并制成文件，并且變更應(yīng)予以正式發(fā)布。
三、系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)（與USP、EP對比列表統(tǒng)計(jì)異同）
色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個(gè)參數(shù)。按各品種正文項(xiàng)下要求對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，必要時(shí)，可對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以符合要求。
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參數(shù) |
2020版《中國藥典》 |
USP |
EP |
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理論踏板數(shù)（n） |
按 n = 16(tR/W)2或 n = 5.54(tR/Wh/2)2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。tR、W、Wh/2可用時(shí)間或長度計(jì)（下同），但應(yīng)取相同單位。 |
計(jì)算公式同《中國藥典》 峰谷比（p/v）峰谷比用于當(dāng)分離兩峰的基線無法達(dá)到時(shí)，作為在有關(guān)物質(zhì)的測定時(shí)的系統(tǒng)適用性參數(shù)，如下圖3所示，當(dāng)使用了電子積分儀時(shí)，可能以n = 5.54(tR/Wh/2)2方便的測定理論踏板數(shù)，當(dāng)有爭議時(shí)，將只使用基于基線處的峰寬度的方程式。 |
僅收錄了半峰寬的計(jì)算公式， n = 5.54(tR/Wh/2)2 峰谷比同USP |
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分離度（R） |
除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于 1.5。分離度的計(jì)算公式為： R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)或R=2(tR2-tR1)/1.70( W1,h/2+ W2,h/2) 式中 tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時(shí)間； tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時(shí)間； W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬，如下圖4所示。 當(dāng)對測定結(jié)果有異議時(shí)，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。 |
當(dāng)使用電子積分儀時(shí)，R=1.18(tR2-tR1)/ ( W1,h/2+ W2,h/2)，其它同《中國藥典》
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對于基線分離，分離度應(yīng)大于1.5，R=1.18(tR2-tR1)/ ( W1,h/2+ W2,h/2) 如果不是基線分離，上述公式不適用 |
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靈敏度 |
定量測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于 10；定性測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于 3 |
信噪比S/N=2H/h 定量測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于 10；定性測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于 3 定量限需滿足準(zhǔn)確度和精密度的相關(guān)要求。見下圖5 |
同USP相關(guān)要求 |
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拖尾因子（T） |
T=W0.05h/2d1 W0.05h為 5％峰高處的峰寬；d1為峰頂在 5%峰高處橫坐標(biāo)平行線的投影點(diǎn)至峰前沿與此平行線交點(diǎn)的距離（見下圖6） 以峰高作定量參數(shù)時(shí)，除另有規(guī)定外，T 值應(yīng)在 0.95～1.05 之間 以峰面積作定量參數(shù)時(shí)，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，但嚴(yán)重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性，此時(shí)應(yīng)在品種正文項(xiàng)下對拖尾因子作出規(guī)定。 |
計(jì)算公式同《中國藥典》
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計(jì)算公式同《中國藥典》 通常對稱因子要求0.8-1.5 |
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重復(fù)性 |
除另有規(guī)定，外標(biāo)法，連續(xù)5針RSD應(yīng)不大于2.0%；內(nèi)標(biāo)法，配制80%、100%、120%三種不同濃度溶液，分別至少進(jìn)樣2次，平均校正因子的RSD不得過2.0%，當(dāng)待測成分是微量或痕量，進(jìn)樣量少或其色譜峰響應(yīng)值較小時(shí)，對相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求可適當(dāng)放寬。 |
RSD%=KB√n/t90%，n-1，RSD為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為常數(shù)0.349，B為各論中給出的上限減去100%（引申為含量的范圍要求），n為參考溶液重復(fù)進(jìn)樣的次數(shù)（3 ≤n ≤6），t90%是在n-1自由度90%的概率下的一組t值（雙側(cè)） （見下圖7） |
同USP |
圖3
圖4
圖5
圖6
圖7
結(jié)論：各國藥典對系統(tǒng)適用性的要求不盡相同，但涉及的計(jì)算公式基本一致，研究中應(yīng)根據(jù)具體品種的特性，制定適合自己的系統(tǒng)適用性要求，確保檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，可重現(xiàn)。
解析：該段描述中“保留時(shí)間應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異”該如何判斷，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義首先應(yīng)具備一定的樣本量，若采用T-test，以P值判定是否有差異性，僅考慮的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)意義上的差異性，而方法本身的偏離無法考慮在內(nèi)，容易做出誤判。USP23版<621>曾規(guī)定保留時(shí)間的比值在0.98-1.02之間為符合規(guī)定，如不符合，混合相同體積的分析溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入色譜中，混合溶液譜圖不得有肩峰，峰面積與混合體積成比例。該方式對于保留時(shí)間短的化合物控制過于嚴(yán)格，對于保留時(shí)間長的化合物控制又過于寬松。個(gè)人認(rèn)為可采用保留時(shí)間T均值±3sigma方法確定保留時(shí)間的區(qū)間，但該方式需要具有一定的樣本量作為基礎(chǔ)，舉例如下：
|
次數(shù) |
保留時(shí)間 |
|
1-1 |
3.154 |
|
1-2 |
3.152 |
|
1-3 |
3.034 |
|
1-4 |
3.215 |
|
1-5 |
3.065 |
|
均值 |
3.124 |
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SD |
0.073 |
|
3SD |
0.220 |
|
區(qū)間 |
3.124±0.22 |
若超出該范圍，建議采用相對保留時(shí)間對比結(jié)合光譜相似度或質(zhì)譜的方式進(jìn)行。
（2）利用光譜相似度定性
化合物的全波長掃描紫外光譜圖提供一些有價(jià)值的定性信息。待測成分的光譜與對照品的光譜的相似度可用于輔助定性分析。用二極管陣列檢測器可得到更多的信息，包括色譜信號、時(shí)間、波長的三維色譜光譜圖，其定性結(jié)果以及用于峰純度分析，與紫外檢測器相比具有更大的優(yōu)勢。同樣應(yīng)注意，兩個(gè)光譜不同的色譜峰表征了不同化合物，但兩個(gè)光譜相似的色譜峰未必可歸屬為同一化合物。
（3）利用質(zhì)譜檢測器定性
利用質(zhì)譜檢測器提供的色譜峰分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的信息進(jìn)行定性分析，可獲得比僅利用保留時(shí)間或增加光譜相似性進(jìn)行定性分析更多的、更可靠信息，不僅可用于已知物的定性分析，還可提供未知化合物的結(jié)構(gòu)信息。
五、多維液相色譜（新增）
多維色譜又稱為色譜/色譜聯(lián)用技術(shù)，是采用匹配的接口將不同分離性能或特點(diǎn)的色譜連接起來，第一級色譜中未分離開或需要分離富集的組分由接口轉(zhuǎn)移到第二級色譜中，第二級色譜仍需進(jìn)一步分離或分離富集的組分，也可以繼續(xù)通過接口轉(zhuǎn)移到第三級色譜中。理論上，可以通過接口將任意級色譜串聯(lián)或并聯(lián)起來，直至將混合物樣品中所有的難分離、需富集的組分都分離或富集之。但實(shí)際上，一般只要選用兩個(gè)合適的色譜聯(lián)用就可以滿足對絕大多數(shù)難分離混合物樣品的分離或富集要求。因此，一般的色譜/色譜聯(lián)用都是二級，即二維色譜。
在二維色譜的術(shù)語中，1D和2D分別指一維和二維；而1D和2D則分別代表第一維和第二維。
二維液相色譜可以分為差異顯著的兩種主要類型。若兩種色譜的聯(lián)用僅是通過接口將前一級色譜中某一（些）組分傳遞到后一級色譜中繼續(xù)分離，這是中心切割式二維色譜（heart-cutting mode two-dimensional chromatography），一般用LC-LC（也有用LC+LC）表示。但當(dāng)兩種色譜聯(lián)用，接口將前一級色譜中的全部組分連續(xù)地傳遞到后一級色譜中進(jìn)行分離，這種二維色譜稱為全二維色譜（comprehensive two-dimensional chromatography），一般用LC×LC表示。LC×LC是將1D色譜柱的流出物連續(xù)轉(zhuǎn)移至2D色譜柱。相比之下，LC-LC則是將1D流出物選擇性地（部分地）轉(zhuǎn)移至2D色譜柱。此外，這兩種類型下還有若干子類，包括選擇性二維色譜（sLC×LC）和多中心切割2D-LC（mLC-LC）。
LC-LC 或 LC×LC 兩種二維色譜可以是相同的分離模式和類型，也可以是不同的分離模式和類型。接口技術(shù)是實(shí)現(xiàn)二維色譜分離的關(guān)鍵之一，原則上，只要有匹配的接口，任何模式和類型的色譜都可以聯(lián)用。和一維色譜一樣，二維色譜也可以和質(zhì)譜、紅外和核磁共振等聯(lián)用。
目前該項(xiàng)技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)、中藥活性物質(zhì)研究中占有十分重要的地位，隨著化藥雜質(zhì)研究的深入，該項(xiàng)技術(shù)必將有廣泛的應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)
[1] 2020版0512高效液相色譜法征求意見稿
[2] 分析方法驗(yàn)證基礎(chǔ)導(dǎo)論
[3] 有關(guān)液相色譜和氣相色譜中保留時(shí)間的一致性
[4] 歐洲藥典EP9.0
[5] 美國藥典USP40-NF35
來源：雷陣雨藥事縱橫
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