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色譜定量分析，顧名思義就是色譜分析方法來測定組分的含量，主要分為面積百分比法、歸一化法、外標法、內(nèi)標法和標準加入法，色譜定量分析首先需要明確的概念是響應因子，不同的化合物在檢測器的響應是不一樣的，簡單地舉個例子說，相同濃度的化合物A和B，相同的進樣量，得到的峰高和峰面積不一定一樣的，響應因子的計算式如下：

式中，w為化合物的含量，A為響應值，一般為峰面積或峰高，本文以峰面積為例。由于不同的化合物在同一個檢測器的響應因子不同，甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應因子不同，簡單地說就是化合物在檢測器的響應不呈線性，或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時，除需要考慮是相對定量還是絕對定量外，同時需要考察化合物的線性響應范圍、是否有合適內(nèi)標、是否有標準品等。本文簡單介紹下色譜分析中常用的一些定量方法。

1.      歸一化法：

把所有出峰的組分含量之和按100%計算的定量方法，其中組分i的質(zhì)量分數(shù)可按下式計算：

式中，f為響應因子，A為峰面積，w為含量

歸一化法屬于相對定量，優(yōu)點是簡便、準確，進樣量、流速、柱溫等操作條件對定量結果的影響小，但要求所有組分都流出色譜柱，并被檢測器檢出，同時需要測定各個組分的響應因子，而各個組分的響應因子的測定都需要基準物質(zhì)，所以使用受到限制。歸一化法主要用于GC，因為GC的一些檢測器如FID對某些組分的響應因子相近或有一定的規(guī)律，可以在文獻上查到，當響應因子相近時，可以直接用面積歸一化法。

2.峰面積百分比法：

峰面積百分比法也是相對定量，忽略各個組分的響應因子或者默認為每個組分的響應因子相同，計算如下式：

峰面積百分比法適合于不需要準確定量，同時難以得到響應因子的情況。

3.外標法：

外標法有標準曲線和單點外標法，標準曲線法是用標準品配制一系列濃度的標準溶液樣品，通過不同濃度的標準溶液及其對應響應值，繪制樣品濃度和響應值關系曲線：

將待測組分的響應值帶入工作曲線可以計算組分的含量。

單點外標也叫標準品比對法，是將原點和標準溶液的數(shù)據(jù)連成一條直線，如下式的計算：

式中，C_i為待測組分含量，A_i為待測組分的峰面積，A_std為標準溶液中標準物的峰面積，C_std為標準溶液濃度。

外標法屬于絕對定量，繪制好標準曲線后，測定該組分的峰面積或峰高后，代入標準曲線就可以計算得到含量，待測組分含量應該是在標準曲線濃度范圍內(nèi)的，HPLC定量比較多使用外標法，外標法需要每次樣品分析的色譜條件盡量一致，否則需要重新測定標準曲線樣品得到新的標準曲線。一般一個分析批至少需要一條標準曲線，生物樣品分析時除需要考察標準曲線線性范圍、分析準確度和精密度外，還需要考察一個分析批能夠耐受的樣品數(shù)量，即在一個分析批內(nèi)多少樣品數(shù)量范圍內(nèi)定量是準確的。

4.內(nèi)標法：

內(nèi)標法是選擇合適的化合物作為待測組分的參比物，定量地加到樣品中，根據(jù)待測組分和內(nèi)標的響應值（峰面積或峰高）之比，以及內(nèi)標物的含量來計算待測組分的含量。

式中，f_i和f_IS分別為待測組分和內(nèi)標的響應因子，A_i和A_IS為待測組分和內(nèi)標的響應值，w_i和w_IS分別為待測組分含量和內(nèi)標含量。

這種方法需要測定待測物和內(nèi)標物的響應因子，常用于GC中。另一種內(nèi)標比對法是常用于LCMS/MS中，內(nèi)標比對法是在不知道響應因子的情況下的一種內(nèi)標法，先將一定量的內(nèi)標物加入到標準物溶液中，再將相同量的內(nèi)標加入到待測溶液中，分別進樣，按下式計算待測組分含量：

式中，C_i為待測組分含量，A_i為待測組分的峰面積，A_std為標準溶液中標準物的峰面積，C_std為標準溶液濃度，A_IS為內(nèi)標的峰面積。。

內(nèi)標物的選擇是內(nèi)標法的關鍵，內(nèi)標物應滿足以下幾點：

• 待測樣品中不存在

• 不與待測物起反應，不干擾待測物的響應

• 盡可能與待測物性質(zhì)相似，盡可能與待測組分出峰時間相近但要保證與其他組分的峰分離開，LCMSMS分析方法時盡可能選擇同位素內(nèi)標

• 內(nèi)標物加入的量應與待測組分含量接近

• 內(nèi)標物應該是穩(wěn)定的純物質(zhì)

內(nèi)標法的優(yōu)點是：進樣量的變化，色譜條件的微小變化對定量結果的影響不大，同時也可以校正樣品前處理（提取、濃縮、衍生化等）過程中樣品的損失。如果可以選擇合適的內(nèi)標，內(nèi)標法定量的準確度和精密度是優(yōu)于外標法的。

5.標準加入法：

標準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標法，是以待測組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入前后待測組分的峰面積（或峰高），從而計算出樣品中待測組分的含量。以峰面積計算方法為例，標準加入法的計算如下：

式中，Δw_i為加入的標準品的量，A_i為待測組分的峰面積，ΔA_i為加入標準品后待測組分峰面積的增加量，w_i為原樣品中待測組分的含量。