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用于動(dòng)物源性醫(yī)療器械的生物材料因具有良好的生物相容性和組織誘導(dǎo)活性，且材料來(lái)源方便，使動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品的研發(fā)成為熱點(diǎn)，被廣泛用于外科的創(chuàng)傷修復(fù)等再生醫(yī)療領(lǐng)域[1]。動(dòng)物源生物材料的來(lái)源涉及的動(dòng)物種屬有豬、牛、馬、鼠、雞、蠶、海洋生物等。其組織來(lái)源為各種脫細(xì)胞基質(zhì)、心包、表皮、真皮、血管、神經(jīng)、肌腱、雞冠、蠶絲、鼠尾等。其臨床應(yīng)用在我國(guó)有以下醫(yī)療器械：（1）植入材料，如異種皮質(zhì)骨、人工骨、骨修復(fù)材料、骨填充材料；（2）心臟或組織修補(bǔ)材料，如?；蜇i心包生物瓣膜、心臟補(bǔ)片；（3）眼科植入材料，如異種角膜（豬源）、結(jié)膜、眼內(nèi)充填材料等；（4）接觸式人工器官，如人工皮膚、異體脫細(xì)胞真皮；（5）醫(yī)用衛(wèi)生材料及生物敷料；（6）可吸收性止血、防黏連材料，如生物蛋白膠、醫(yī)用膠原膜、透明質(zhì)酸；（7）醫(yī)用縫合材料，如醫(yī)用可吸收膠原縫合線、羊腸線等。我國(guó)動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用居世界之首。

 

動(dòng)物源性醫(yī)療器械的主要安全風(fēng)險(xiǎn)是外源因子微生物類污染和傳播問(wèn)題、熱原、免疫學(xué)或毒理學(xué)反應(yīng)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織先后發(fā)布了4項(xiàng)動(dòng)物源性醫(yī)療器械的風(fēng)險(xiǎn)管理標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)也已及時(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，成為醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[2-5]。在這系列標(biāo)準(zhǔn)的“第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理應(yīng)用”中，規(guī)定了鑒別與該類器械相關(guān)的危害與危害情況的判定、對(duì)所產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)、對(duì)這些風(fēng)險(xiǎn)的控制以及對(duì)控制有效性的監(jiān)視程序。概述了殘余風(fēng)險(xiǎn)可接受性的判斷過(guò)程。提出了對(duì)采用動(dòng)物組織或其衍生物制造的醫(yī)療器械有關(guān)危害的風(fēng)險(xiǎn)管理的要求和指南。然而，這些標(biāo)準(zhǔn)中提出的是原則和管理程序要求，側(cè)重于微生物類外源因子污染的防控和病毒滅活驗(yàn)證的要求。動(dòng)物源性生物材料應(yīng)用于人體面臨著免疫排斥反應(yīng)潛在風(fēng)險(xiǎn)，直接影響著材料的安全性和有效性[6]。而常規(guī)的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)系列標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 16886）和其他醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也都主要適用于常規(guī)材料（如金屬、陶瓷、高分子等）的醫(yī)療器械，對(duì)動(dòng)物源性醫(yī)療器械特有的異種免疫原性問(wèn)題缺乏專屬性和特異性。沒(méi)有針對(duì)動(dòng)物源性醫(yī)療器械專屬的檢測(cè)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，缺乏精準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)控制手段。

 

中國(guó)食品藥品檢定研究院（以下簡(jiǎn)稱中檢院）醫(yī)療器械檢定所的質(zhì)量評(píng)價(jià)室，在再生型醫(yī)用植入器械國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室首席專家項(xiàng)目（2012-2016）-動(dòng)物源性生物材料免疫原性檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)研究（2012NELRMD002）和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016-2020）-生物源性材料及產(chǎn)品的檢測(cè)與評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化研究（2016YFC1103203）的資助下，建立了一系列檢測(cè)與評(píng)價(jià)動(dòng)物源性醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險(xiǎn)和質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)、方法和標(biāo)準(zhǔn)。其中的部分檢測(cè)技術(shù)涉及的檢測(cè)項(xiàng)目已被《動(dòng)物源性醫(yī)療器械注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（2017年修訂版）[7]收錄。以下予以詳細(xì)介紹。

 

1 殘留DNA檢測(cè)

動(dòng)物源性生物材料大多是經(jīng)脫細(xì)胞處理的組織基質(zhì)類材料，以達(dá)到去除異種免疫原性，減少免疫排斥反應(yīng)的目的。殘留DNA檢測(cè)是脫細(xì)胞基質(zhì)類生物材料進(jìn)行脫細(xì)胞工藝評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。我國(guó)藥典中雖然有生物制品DNA殘留測(cè)定方法，但不能直接用于醫(yī)療器械的檢測(cè)。因?yàn)獒t(yī)療器械幾乎都是固體或者凝膠狀的材料，需要進(jìn)行有效的樣品前處理，消化固體的基質(zhì)成分，釋放殘留的DNA后方能進(jìn)行檢測(cè)。另外，由于主要成分是基質(zhì)纖維蛋白，即使進(jìn)行充分的消化，基質(zhì)纖維蛋白對(duì)檢測(cè)的干擾也非常大，需要進(jìn)行殘留DNA的提取，然后再進(jìn)行測(cè)定。為此，我們建立了三步法：酶分解基質(zhì)釋放核酸、核酸純化（增加同步回收率實(shí)驗(yàn)）和熒光染色進(jìn)行核酸測(cè)定[8]。以該方法為基礎(chǔ)制定了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品第25部分：動(dòng)物源性生物材料DNA殘留量測(cè)定法：熒光染色法》（YY/T 0606.25-2014）[9]。該標(biāo)準(zhǔn)于2014年發(fā)布，2015年開(kāi)始實(shí)施，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外脫細(xì)胞工藝評(píng)價(jià)方法標(biāo)準(zhǔn)的空白。該標(biāo)準(zhǔn)被2017年發(fā)布的修訂版《動(dòng)物源性醫(yī)療器械注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》收錄，作為該類產(chǎn)品技術(shù)要求的必檢項(xiàng)目，用于產(chǎn)品的工藝研究、工藝有效性驗(yàn)證、注冊(cè)檢驗(yàn)和質(zhì)量控制。

 

關(guān)于DNA殘留量的安全限值制定，需要結(jié)合產(chǎn)品的使用面積、使用量、創(chuàng)面類型、接觸的部位、材料的來(lái)源及降解特性等，同時(shí)結(jié)合免疫原性殘留風(fēng)險(xiǎn)分析和評(píng)價(jià)結(jié)果，綜合評(píng)價(jià)其風(fēng)險(xiǎn)程度，確定限量值。

 

殘留DNA是脫細(xì)胞工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，異種核酸本身雖然可能造成一定的不可預(yù)測(cè)的免疫反應(yīng)，但不是主要的風(fēng)險(xiǎn)因素。為了降低DNA殘留建議不使用核酸分解酶，因?yàn)檫@種方法雖降低了核酸的殘留，但不能減少其他細(xì)胞成分的殘留，達(dá)不到降低整體免疫原性的目的，反而引入了核酸分解酶試劑殘留的額外風(fēng)險(xiǎn)。

 

該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)是國(guó)際首創(chuàng)，ASTM正在研發(fā)中的標(biāo)準(zhǔn)“脫細(xì)胞基質(zhì)材料（ECM）脫細(xì)胞工藝評(píng)價(jià)指南”（WK 57514）中把殘留DNA檢測(cè)列為首選項(xiàng)目，但是，沒(méi)有提供標(biāo)準(zhǔn)化方法。中檢院作為全國(guó)外科植入物和矯形器械標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC110/SC3）秘書(shū)處單位，正在組織申請(qǐng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)，于2019年國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化工作年度會(huì)議上已被列為外科植入物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織工程分技術(shù)委員會(huì)（ISO/ TC150/SC7）的標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃。該項(xiàng)工作的推進(jìn)將把中國(guó)該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)升級(jí)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，引領(lǐng)該領(lǐng)域國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化工作的發(fā)展。

 

2 殘留Gal抗原檢測(cè)

 

動(dòng)物源性生物材料的殘留異種免疫原是造成宿主免疫排斥反應(yīng)的主要根源和潛在風(fēng)險(xiǎn)，直接影響著產(chǎn)品的安全性和有效性。免疫反應(yīng)嚴(yán)重或者長(zhǎng)期慢性的局部免疫反應(yīng)，常常會(huì)導(dǎo)致植入物局部纖維化明顯，形成纖維包裹，最后以填充在局部的異物形式存留，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)所期望的真正的組織再生和重建。因此，檢測(cè)產(chǎn)品的異種免疫原殘留是質(zhì)量控制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。然而，可能引起人體免疫排斥和免疫毒理學(xué)反應(yīng)的異種免疫原有無(wú)數(shù)種類，有些比較明確，而大多數(shù)則是未知的，沒(méi)有辦法逐一檢測(cè)和評(píng)價(jià)。因此，需要選擇具有代表性的已知的異種免疫原，作為去除免疫原工藝評(píng)價(jià)的指征，進(jìn)行工藝評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。

 

已有研究表明異種α-半乳糖基抗原(α-1, 3- galactosyle，α-Gal)是異種器官移植超急性免疫排斥反應(yīng)中的主要靶抗原[1, 6, 10]。α-Gal是含有聚乳糖胺核心，末端殘基含有細(xì)胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，廣泛存在于豬、牛、馬等低等動(dòng)物體內(nèi)。人體、類人猿、舊世紀(jì)猴的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因有2個(gè)堿基錯(cuò)位變異而不表達(dá)Gal抗原[10-11]，但人類血清中存在高滴度的抗α-Gal抗體（占總血清球蛋白的1%~3%），而當(dāng)人體接受含有Gal抗原的異種器官移植或生物材料植入時(shí)會(huì)導(dǎo)致超急性或慢性的免疫排斥反應(yīng)[12-14]。因此，選擇Gal抗原作為脫細(xì)胞工藝中免疫原除去的評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以作為重要的質(zhì)控指標(biāo)之一，評(píng)價(jià)產(chǎn)品的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。

 

本課題組首先研制了含有Gal抗原的陽(yáng)性生物材料參考品和不含Gal抗原的陰性生物材料參考品，于2018年已作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)上市（Gal抗原檢測(cè)生物材料參考品，標(biāo)準(zhǔn)品號(hào)：380001- 201701，提供單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院）。本課題組在Gal抗原非定量檢測(cè)方法研究的基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)，利用人工合成的Gal抗原（Gal-BSA）與不含Gal抗原的陰性生物材料參考品，制備模擬脫細(xì)胞基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，再利用特異性的抗Gal抗體，建立了酶聯(lián)免疫抑制方法，定量檢測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)材料中殘留的Gal抗原[15-17]?；谠摲椒ǖ男袠I(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品動(dòng)物源性支架材料的殘留α-Gal抗原檢測(cè)》（YY/T 1561-2017）[18]，于2017年發(fā)布，2018年實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)方法填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外去除免疫原工藝評(píng)價(jià)方法的空白，已被《動(dòng)物源性醫(yī)療器械注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（2017年修訂版）收錄；同時(shí)也被正在研發(fā)中的ASTM“脫細(xì)胞基質(zhì)材料（ECM）脫細(xì)胞工藝評(píng)價(jià)指南”標(biāo)準(zhǔn)（WK 57514）收錄。組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會(huì)正在計(jì)劃將該項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)升級(jí)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，申請(qǐng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)。

 

由于標(biāo)準(zhǔn)中的方法使用了進(jìn)口的人工合成Gal抗原，其不同的合成批次所含的Gal抗原表位稍有差異；所使用的市售特異性抗Gal抗體是非純化的融合細(xì)胞上清液，批次不同其活性有差異。這兩個(gè)不確定因素導(dǎo)致采用標(biāo)準(zhǔn)方法時(shí)需要根據(jù)試劑的批次進(jìn)行試驗(yàn)體系的優(yōu)化。為此，本課題組研制了Gal抗原檢測(cè)試劑盒，并申請(qǐng)了發(fā)明專利，試劑盒專利于2015年獲得授權(quán)[19]。為了支持行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，中檢院進(jìn)行了專利的轉(zhuǎn)化，組織研制優(yōu)化了試驗(yàn)體系的“α-Gal抗原定量檢測(cè)試劑盒（標(biāo)準(zhǔn)方法）”（美壇，07101）產(chǎn)品。

 

不同組織來(lái)源的基質(zhì)材料，其Gal抗原含量相差懸殊，從幾倍到上千倍，因此，需要綜合評(píng)價(jià)其殘留的風(fēng)險(xiǎn)，如預(yù)期使用部位（植入體內(nèi)、體表外用）、使用面積、使用量、創(chuàng)面類型及使用局部血運(yùn)情況、材料的組織來(lái)源及降解特性等，同時(shí)結(jié)合免疫原性殘留風(fēng)險(xiǎn)分析和評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行定值限量。比如豬角膜組織的Gal抗原很低，而皮膚、心包類組織則高達(dá)角膜組織的數(shù)千倍，因此，單獨(dú)依靠Gal抗原清除率作為質(zhì)控指標(biāo)是不科學(xué)的，應(yīng)進(jìn)行定量檢測(cè)。

 

3 免疫原性殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

 

由于生物體免疫學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性，異種免疫原性反應(yīng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫，是生物體內(nèi)的全身性、系統(tǒng)性反應(yīng)，也是無(wú)數(shù)異種免疫原的綜合反應(yīng)。動(dòng)物源性生物材料的異種免疫原性殘留風(fēng)險(xiǎn)需要結(jié)合脫細(xì)胞工藝的評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制（如殘留DNA、殘留Gal抗原檢測(cè)），一級(jí)免疫學(xué)反應(yīng)評(píng)價(jià)（如局部刺激、致敏等）、體外細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)（如淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)等），進(jìn)行綜合的免疫原性殘留風(fēng)險(xiǎn)分析。如果不能充分評(píng)價(jià)其最終的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)是否可接受，則需要進(jìn)行生物體內(nèi)的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)。

 

3.1 體外免疫原性殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

中檢院組織工程分技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC110/ SC3）制定了“組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第15部分評(píng)價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法-淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（YY/T 0606.15-2015）[20]行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)提供了評(píng)價(jià)動(dòng)物源性醫(yī)療器械的細(xì)胞免疫方法。然而，由于淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)困難，需要先建立相對(duì)穩(wěn)定的試驗(yàn)體系。本課題組系統(tǒng)考察了如淋巴細(xì)胞的來(lái)源、接種數(shù)量、受試物暴露時(shí)間及細(xì)胞培養(yǎng)周期、陽(yáng)性對(duì)照品的選擇等試驗(yàn)條件[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物源組織（原材料）雖能引起淋巴細(xì)胞增殖，但不是典型的T淋巴細(xì)胞增殖，而常被用于陽(yáng)性對(duì)照品細(xì)胞分裂原（Con A）則是典型的T淋巴細(xì)胞增殖。因此，如果選擇Con A作為陽(yáng)性對(duì)照品，應(yīng)考慮其局限性；建議增加動(dòng)物源組織（原材料）作為陽(yáng)性對(duì)照品，可以更客觀地評(píng)價(jià)試驗(yàn)體系對(duì)動(dòng)物源材料的敏感性，從而客觀地評(píng)價(jià)動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。另外，受試樣品的暴露/添加方式（如浸提液、勻漿液）檢測(cè)淋巴細(xì)胞活性的方法（如MTT法、CCK-8法的敏感性等），需要充分考察其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

 

3.2 體內(nèi)免疫原性殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

所有低等動(dòng)物體內(nèi)都表達(dá)Gal抗原，人體卻不表達(dá)Gal抗原，而由于腸道細(xì)菌攜帶大量的Gal抗原使得人體內(nèi)存在高水平的抗Gal抗體。因此，科學(xué)研究表明動(dòng)物組織中的Gal抗原是引起人體超急性免疫排斥反應(yīng)的主要靶抗原。如果按照常規(guī)的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法，采用野生型動(dòng)物（如小鼠）評(píng)價(jià)動(dòng)物源材料的免疫原性，顯然是不科學(xué)、不合理的。早在1984年，關(guān)于Gal抗原相關(guān)的異種免疫學(xué)研究即已開(kāi)始[12]。國(guó)際上已有關(guān)于Gal抗原缺失（調(diào)控基因GGTA1被敲除）小鼠、豬、甚至牛的研究。其中，GGTA1基因敲除小鼠是最早被用來(lái)研究α-Gal相關(guān)的免疫學(xué)反應(yīng)的模式動(dòng)物[24-25]。既往研究證明GGTA1基因敲除小鼠免疫后誘導(dǎo)的抗-Gal抗體與α-Gal結(jié)合的親和性和人的抗Gal抗體相似，能夠誘導(dǎo)Gal抗原陽(yáng)性異種心臟補(bǔ)片的超急性免疫排斥反應(yīng)[26]。異種角膜雖然免疫原性較低，但沒(méi)有進(jìn)行任何處理的新鮮豬角膜移植到Gal抗原缺失小鼠眼部，仍然出現(xiàn)顯著的血清特異性抗-Gal IgG抗體的升高，局部抗-Gal IgG和IgM抗體的增加，而野生型小鼠未出現(xiàn)明顯變化；同時(shí)，與新鮮豬角膜相比，脫細(xì)胞處理后的豬角膜局部抗-Gal IgG和IgM抗體明顯減少[27]。這一研究結(jié)果充分證明Gal抗原缺失小鼠可以用于動(dòng)物源材料的免疫原性評(píng)價(jià)。膜類動(dòng)物源材料，如心包組織，在用于生物瓣膜時(shí)最大的問(wèn)題是鈣化，從而導(dǎo)致瓣膜滲漏，其中，局部免疫原性反應(yīng)與鈣化是密切相關(guān)的。有研究將豬和牛的心包組織植入到Gal抗原缺失小鼠，并與野生型小鼠對(duì)比評(píng)價(jià)了異種免疫反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gal抗原缺失小鼠具有更高的敏感性[28]。然而，目前Gal抗原缺失小鼠只限于國(guó)外研發(fā)團(tuán)隊(duì)使用，無(wú)法進(jìn)口到國(guó)內(nèi)。α-Gal主要受α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α1, 3-galactosyltransferase, α-GT or GGTA1）或（和）異構(gòu)神經(jīng)酰胺三己糖苷合成酶（isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3 synthase, iGb3S）調(diào)控[29]。有研究顯示GGTA1基因敲除不能完全消除Gal抗原的表達(dá)[30-31]，提示iGb3S可能是另一個(gè)合成Gal抗原的酶。因此，本課題組研制了GGTA1和iGb3S基因單獨(dú)敲除的小鼠（GGTA1 KO, iGb3S KO）和2個(gè)基因同時(shí)敲除的雙基因敲除小鼠（GGTA1/iGb3S DKO）。本課題組所研制的具有中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的3種Gal抗原缺失小鼠申請(qǐng)了3項(xiàng)發(fā)明專利，其中2項(xiàng)發(fā)明專利已獲授權(quán)[32-33]。研究結(jié)果在國(guó)際上首次證明了iGb3S基因參與了Gal抗原的表達(dá)調(diào)控，iGb3S基因敲除減少了Gal抗原表達(dá)（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟）約5.19%~21.74%[34]。但是，研究表明，由于Gal抗原表達(dá)僅輕度較少，iGb3S KO小鼠與野生型小鼠一樣，對(duì)動(dòng)物源性組織并不產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)。研究結(jié)果表明，GGTA1 KO小鼠的Gal抗原表達(dá)（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟）減少了約98.45%~99.77%，這一結(jié)果與國(guó)際報(bào)道相近，證明GGTA1是Gal抗原的主要調(diào)控基因，但不是唯一的調(diào)控基因。GGTA1/iGb3S DKO小鼠的研究結(jié)果在國(guó)際上首次證明了GGTA1和iGb3S 2個(gè)基因同時(shí)敲除可以使Gal抗原表達(dá)全部消失。通過(guò)研究GGTA1 KO和GGTA1/iGb3S DKO對(duì)含Gal抗原受試物（兔血紅細(xì)胞及牛源骨）的敏感性，證實(shí)了二者對(duì)動(dòng)物源組織同樣具有足夠高的敏感性；GGTA1/iGb3S DKO對(duì)兔血紅細(xì)胞膜（含有大量Gal抗原）的免疫誘導(dǎo)并沒(méi)有比GGTA1 KO具有更高的敏感性[35]，但對(duì)牛源骨組織顯示有更多的免疫學(xué)指標(biāo)的變化?；谏鲜?種Gal抗原缺失小鼠對(duì)不同動(dòng)物組織的敏感性尚需開(kāi)展大量研究，考察其免疫毒理學(xué)反應(yīng)特點(diǎn)。

 

在大量基于GGTA1基因敲除Gal抗原缺失小鼠的評(píng)價(jià)和應(yīng)用研究[36-39]中，研究結(jié)果表明，無(wú)論是含異種免疫原較低的角膜，還是中度免疫原性的異種骨，高免疫原性的異種真皮和心包，Gal抗原缺失小鼠試驗(yàn)體系都能夠在一定程度上反映原材料與免疫原去除產(chǎn)品的差異，提示可以應(yīng)用于動(dòng)物源材料免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)。中檢院已將基于Gal抗原缺失小鼠的免疫學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法，作為非標(biāo)方法獲得了CNAS認(rèn)證。

 

在基于Gal抗原缺失小鼠對(duì)動(dòng)物源材料進(jìn)行免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)體系中，本課題組同時(shí)建立了材料特異性抗體的檢測(cè)方法。其實(shí)驗(yàn)原理：用沒(méi)有去除免疫原的原材料勻漿液（含有全部的免疫原蛋白），制備固相抗原包被酶標(biāo)板，捕獲植入了試驗(yàn)樣品的Gal抗原缺失小鼠血清中的材料（試驗(yàn)樣品）特異性抗體，并作為非標(biāo)方法已獲得了CNAS認(rèn)證。

 

通過(guò)建立這些針對(duì)異種免疫原性的精準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法和手段，為許多動(dòng)物源性醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)提供了擬注冊(cè)產(chǎn)品的免疫原性評(píng)價(jià)報(bào)告。特別是為數(shù)家因免疫學(xué)評(píng)價(jià)資料不符合要求而被要求補(bǔ)發(fā)資料的企業(yè)提供了能客觀地反映產(chǎn)品殘存免疫原風(fēng)險(xiǎn)的免疫學(xué)評(píng)價(jià)報(bào)告。為注冊(cè)前產(chǎn)品的精準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)控制提供了有力的技術(shù)支持。

 

3.3 臨床免疫原性殘存風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)

由于種屬的遺傳學(xué)差異，以及動(dòng)物源組織引起人體免疫排斥反應(yīng)的異種免疫原的復(fù)雜性，盡管使用Gal抗原缺失小鼠，其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果也不能完全外推到人體的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。因此，在臨床試驗(yàn)研究中應(yīng)盡量設(shè)定一些對(duì)動(dòng)物源材料特異性的免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行殘存免疫原風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。如：接受動(dòng)物源性醫(yī)療器械植入手術(shù)的病人血清中抗GalIgG、抗GalIgM的檢測(cè)。可通過(guò)患者術(shù)前和術(shù)后不同時(shí)間的特異性抗Gal抗體水平的對(duì)比，分析產(chǎn)品的殘存免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。中檢院已建立了能夠相對(duì)定量的人血清中抗GalIgG、抗GalIgM檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒；收集了300余份健康人血清的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可以為相關(guān)臨床試驗(yàn)研究提供技術(shù)支持。

 

4 基于動(dòng)物試驗(yàn)的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)的幾點(diǎn)共識(shí)

 

由于生物體對(duì)異種免疫原的免疫毒理學(xué)反應(yīng)是體內(nèi)系統(tǒng)反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫，還有非特異性的炎癥反應(yīng)，對(duì)植入物的異物反應(yīng)等也會(huì)參與免疫反應(yīng)的最終表現(xiàn)。而需要進(jìn)行免疫學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的醫(yī)療器械產(chǎn)品大多是以固體形式為主的植入材料，很多具有免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的材料具有可降解特性。因此，開(kāi)展體內(nèi)免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)時(shí)試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)很重要。醫(yī)療器械國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.20僅提供了免疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則，具體的試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)需要根據(jù)產(chǎn)品的特性和預(yù)期用途，進(jìn)行個(gè)案考慮（Case-by-Case）。

 

中檢院國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“生物源性材料及產(chǎn)品的檢測(cè)與評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化研究”課題組，在2018年11月組織召開(kāi)了動(dòng)物源性醫(yī)療器械免疫學(xué)評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)與應(yīng)用專家研討會(huì)。參會(huì)專家來(lái)自國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心、北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所、天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、清華大學(xué)、空軍軍醫(yī)大學(xué)、西南交通大學(xué)和冠昊生物科技股份有限公司。會(huì)上就基于動(dòng)物試驗(yàn)的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行了深入研討，并初步達(dá)成以下共識(shí)。

 

4.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇

 

1）Gal抗原缺失模式動(dòng)物應(yīng)用具有如下優(yōu)勢(shì)：

① 能夠客觀反映包括Gal抗原殘留的綜合免疫毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，而野生型小鼠由于與其他低等動(dòng)物（如豬、牛等）一樣體內(nèi)表達(dá)Gal抗原，不能客觀反映動(dòng)物源材料對(duì)人體（不表達(dá)Gal抗原，但表達(dá)高水平的抗Gal抗體）的潛在免疫毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)；②與野生型小鼠一樣，可反映其他異種抗原及其工藝中引入抗原的免疫毒理風(fēng)險(xiǎn)，如各種加工助劑的殘留、交聯(lián)等導(dǎo)致的分子結(jié)構(gòu)、分子量大小的改變，可能會(huì)導(dǎo)致終產(chǎn)品的免疫原性增強(qiáng)。

 

2）對(duì)有必要進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)的動(dòng)物源性醫(yī)療器械，包括脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品及由含Gal抗原的原材料提純的動(dòng)物源產(chǎn)品，應(yīng)對(duì)Gal抗原殘留量進(jìn)行質(zhì)量控制；建議采用Gal抗原缺失模式動(dòng)物，結(jié)合材料特異性抗體的檢測(cè)進(jìn)行抗原殘存風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

 

3）純化膠原蛋白類產(chǎn)品，如果膠原蛋白提取的原材料（如牛、豬跟腱）含有一定量的Gal抗原，膠原蛋白類產(chǎn)品中可能存在Gal抗原的殘留，有必要參照上述建議進(jìn)行質(zhì)量控制，并對(duì)殘存抗原進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

 

4.2 試驗(yàn)體系中陽(yáng)性對(duì)照品的選擇和組別設(shè)計(jì)

 

1）陽(yáng)性對(duì)照品設(shè)定的目的：證實(shí)試驗(yàn)體系的敏感性和作為產(chǎn)品免疫原性的陽(yáng)性對(duì)照品。

 

2）常規(guī)采用的“BSA+佐劑”陽(yáng)性對(duì)照品只能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)能力，不能反映試驗(yàn)體系對(duì)動(dòng)物源材料中異種免疫原的敏感性，因此，作為動(dòng)物源產(chǎn)品免疫原性的陽(yáng)性對(duì)照有局限性。

 

3）用未脫細(xì)胞及去除免疫原工藝前的原材料作為陽(yáng)性對(duì)照品，可以反映試驗(yàn)體系對(duì)動(dòng)物源材料中異種免疫原的敏感性，同時(shí)作為產(chǎn)品的含免疫原陽(yáng)性對(duì)照品，可以反映產(chǎn)品去除免疫原工藝的有效性。

 

4）可設(shè)定假手術(shù)組作為陰性對(duì)照組。

 

4.3 受試物暴露方式和實(shí)驗(yàn)周期的設(shè)計(jì)

 

1）暴露方式選擇的原則是盡可能模擬臨床使用。一般采用局部皮下或者肌肉植入的方式。如果植入物預(yù)期臨床使用的部位受力學(xué)因素影響，則選擇肌肉植入的方式更能相對(duì)客觀地反映材料的實(shí)際降解特性。

 

2）植入周期和觀察時(shí)間點(diǎn)可結(jié)合產(chǎn)品的材料特點(diǎn)和降解特性確定。如果是非降解性或者降解很慢的材料，只要科學(xué)合理，可考慮只設(shè)定1個(gè)植入時(shí)間點(diǎn)（如4周）。如果為可降解材料，可根據(jù)材料降解的快慢，采用涵蓋降解周期的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，至少包括植入初期、最大反應(yīng)期（降解最多的時(shí)期）和反應(yīng)平穩(wěn)期或者反應(yīng)消失期。

 

4.4 植入劑量的確定

1）可結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期臨床最大使用量、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可承受的最大植入量和毒理學(xué)種屬放大倍數(shù)確定植入劑量。

 

2）種屬放大倍數(shù)應(yīng)盡可能反應(yīng)預(yù)期臨床使用的最大暴露風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合產(chǎn)品的特性綜合考慮。最低放大倍數(shù)可參考“人體最高用量的10倍”原則（參見(jiàn)《腹腔、盆腔外科手術(shù)用可吸收防粘連產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》）。

 

4.5 劑量-效應(yīng)組別設(shè)計(jì)

如果最大植入劑量的免疫學(xué)反應(yīng)是可接受的，則可不設(shè)定劑量-效應(yīng)組別；如果最大植入劑量的免疫學(xué)反應(yīng)與空白對(duì)照組相比有顯著性差異且是不可接受的，則應(yīng)進(jìn)行劑量-效應(yīng)評(píng)價(jià)。

 

5 總結(jié)和展望

本文所介紹的針對(duì)動(dòng)物源性醫(yī)療器械免疫原性檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)、方法、標(biāo)準(zhǔn)及其應(yīng)用研究，為動(dòng)物源性醫(yī)療器械脫細(xì)胞、去除免疫原的工藝有效性評(píng)價(jià)，體外免疫原性殘余風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，體內(nèi)免疫原性殘余風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，臨床免疫原性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供了切實(shí)可行的手段；為生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量體系中風(fēng)險(xiǎn)管理和產(chǎn)品生產(chǎn)的質(zhì)量控制，為該類產(chǎn)品的科學(xué)審評(píng)審批，指導(dǎo)原則等法規(guī)的制定提供了有力技術(shù)支持。

 

為更充分地評(píng)價(jià)動(dòng)物源性醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，還需要考慮更全面的脫細(xì)胞工藝評(píng)價(jià)，如殘留細(xì)胞核的染色可以考察殘留細(xì)胞的分布；細(xì)胞膜成分如磷酸酯、膜蛋白的定量檢測(cè)；細(xì)胞內(nèi)分子如肌動(dòng)蛋白等定量檢測(cè)；其他免疫相關(guān)的損傷相關(guān)小分子物質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)蛋白定量（S100、HMGB）等。

 

動(dòng)物源性醫(yī)療器械的另一大風(fēng)險(xiǎn)是微生物等外源因子污染和傳播。為有效控制這些風(fēng)險(xiǎn)，要求醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行有效的源頭控制，并根據(jù)需要增加病毒去除/滅活工藝，提供工藝驗(yàn)證資料。病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證通常采用傳統(tǒng)的病毒滴定法，該方法全部依靠肉眼觀察細(xì)胞的病毒病變，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)大約50多塊96孔板逐孔觀察，具有受人的因素影響大、數(shù)據(jù)不能溯源的缺點(diǎn)。中檢院正在推進(jìn)96孔細(xì)胞病毒培養(yǎng)板實(shí)時(shí)自動(dòng)圖像掃描存儲(chǔ)的研究工作，以期實(shí)現(xiàn)圖片數(shù)據(jù)溯源；同時(shí)構(gòu)建細(xì)胞病毒病變圖像數(shù)據(jù)庫(kù)，開(kāi)發(fā)人工智能輔助閱片軟件，以實(shí)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)病毒滴定法的改進(jìn)；另外，正在研究建立細(xì)胞培養(yǎng)-定量PCR聯(lián)合方法，可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，減少人的因素影響，數(shù)據(jù)可溯源，有望實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的病毒滴定法的補(bǔ)充或替代。

 

動(dòng)物源性材料脫細(xì)胞，去除免疫原的工藝中，加工助劑的殘留也是造成毒理反應(yīng)的重要潛在風(fēng)險(xiǎn)，如常被用于脫細(xì)胞去除免疫原的十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），以及用于分解蛋白和核酸的酶類制劑。對(duì)任何的加工助劑應(yīng)進(jìn)行殘留量檢測(cè)，并進(jìn)行剩余風(fēng)險(xiǎn)分析，規(guī)定可接受限量。中檢院正在建立相關(guān)加工助劑殘留的檢測(cè)方法，并推進(jìn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定。

 

參考文獻(xiàn)

[1] Sandrin MS, McKenzie IF. Gal alpha (1, 3)Gal, The Major Xenoantigen(s) Recognised in Pigs by Human Natural Antibodies[J]. Immunol Rev, 1994, 141: 169-90. DOI:10.1111/j.1600-065X.1994.tb00877.x

[2] 全國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). YY/T 0771.1.《動(dòng)物源醫(yī)療器械第1部分: 風(fēng)險(xiǎn)管理應(yīng)用》[S]. 2009.

[3] 全國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). YY/T 0771.2.《動(dòng)物源醫(yī)療器械第2部分: 來(lái)源、收集與處置的控制》[S]. 2009.

[4] 全國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). YY/T 0771.3. 《動(dòng)物源醫(yī)療器械第3部分: 病毒和傳播性海綿狀腦病(TSE)因子去除與滅活的確認(rèn)》[S]. 2009.

[5] 全國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). 《動(dòng)物源醫(yī)療器械第4部分: 傳播性海綿狀腦病(TSE)因子去除與滅活和驗(yàn)證試驗(yàn)的原則》[S]. 2015.

[6] Stephen F. Badylak and Thomas W. Gilbert. Immune Response to Biologic Scaffold Materials[J]. Semin Immunol, 2008, 20(2): 109-116. DOI:10.1016/j.smim.2007.11.003

[7] 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.《動(dòng)物源性醫(yī)療器械注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》(2017年版)[S]. 2017.

[8] 徐麗明, 邵安良, 趙艷紅. 動(dòng)物源性生物材料殘留DNA的定量檢測(cè)法[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2012, 3: 479-485.

[9] 全國(guó)外科植入物和矯形器械標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會(huì). YY/T 0606.25.《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品第25部分: 動(dòng)物源性生物材料DNA殘留量測(cè)定法: 熒光染色法》[S]. 2014.

[10] Oriol R, Ye Y, Koren E, et al. Carbohydrate Antigens of Pig Tissues Reacting with Human Natural Antibodies as Potential Targets for Hyperacute Vascular Rejection in Pigto-man Organ Xenotransplantation[J]. Transplantation, 1993, 56: 1433-1442. DOI:10.1097/00007890-199312000-00031

[11] Galili U, Shohet SB, Kobrin E, et al. Man, Apes, and Old World Monkeys Differ From Other Mammals in the Expression of α-galactosyl Epitopes on Nucleated Cells[J]. J Biol Chem, 1988, 263: 17755-17762.

[12] Galili U, Rachmilewitz EA, Peleg A, et al. Unique Natural Human IgG Antibody with Anti-alpha-galactosyl Specificity[J]. J Exp Med, 1984, 160: 1519-1531. DOI:10.1084/jem.160.5.1519

[13] Galili U, Macher BA, Buehler J, et al. Human Natural Antialpha-galactosyl IgG. Ⅱ. The Specific Recognition of α(1, 3)-linked Galactose Residues[J]. J Exp Med, 1985, 162: 573-582. DOI:10.1084/jem.162.2.573

[14] Galili U, Anaraki F, Thall A, et al. One Percent of Human Circulating B Lymphocytes are Capable of Producing the Natural Anti-Gal Antibody[J]. Blood, 1993, 82: 2485-2493. DOI:10.1182/blood.V82.8.2485.2485

[15] 陸艷, 單永強(qiáng), 邵安良, 等. ELISA抑制法檢測(cè)動(dòng)物組織中α1, 3-Gal抗原[J]. 藥物分析雜志, 2015, 35(10): 40-46.

[16] 單永強(qiáng), 徐麗明, 柯林楠, 等. 動(dòng)物源性生物材料中殘留α-Gal抗原檢測(cè)方法[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2015, 32(3): 680-687.

[17] Lu Y, Shao A, Xu L, et al. A Standardized Quantitative Method for Detecting Remnant Alpha-Gal Antigen in Animal Tissues or Animal Tissue-derived Biomaterials and its Application[J]. Scientific Reports, 2018, 8: 15424. DOI:10.1038/s41598-018-32959-1

[18] 全國(guó)外科植入物和矯形器械標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會(huì). YY/T 1561.《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品動(dòng)物源性支架材料的殘留α-Gal抗原檢測(cè)》[S]. 2017.

[19] 徐麗明, 邵安良, 柯林楠, 等.一種檢測(cè)α-1, 3Gal抗原的試劑盒[P].專利號(hào): NL 201410187336.3, 授權(quán)公告日: 2016年01月06日, 授權(quán)公告號(hào): CN 103983767 B.

[20] 全國(guó)外科植入物和矯形器械標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會(huì). YY/T 0606.15.《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第15部分評(píng)價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法——淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)》[S]. 2015.

[21] 邵安良, 穆鈺峰, 陳亮, 等. 人外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)的優(yōu)化及其應(yīng)用[J]. 藥物分析雜志, 2019, 39(8): 1354-1361.

[22] 陳亮, 穆鈺峰, 邵安良, 等. 動(dòng)物源性生物材料體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)方法的建立[J]. 藥物分析雜志, 2019, 39(8): 1339-1346.

[23] 陳亮, 穆鈺峰, 邵安良, 等. 不同種屬小鼠用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)的比較研究[J]. 藥物分析雜志, 2019, 39(8): 1347-1353.

[24] Tearle RG, Tange MJ, Zannettino ZL, et al. Alpha-1, 3-Galactosyltransferase Knockout Mouse. Implications for Xenotransplantation[J]. Transplantation, 1996, 61(1): 13-19. DOI:10.1097/00007890-199601150-00004

[25] Thall AD. Generation of Alpha 1, 3 Galactosyltransferase Deficient Mice[J]. Subcell Biochem, 1999, 32: 259-279.

[26] Chiang TR, Fanget L, Gregory R, et al. Anti-GAL Antibodies in Humans and 1, 3 Alpha-Galactosyltransferase Knock-out Mice[J]. Transplantation, 2000, 69(12): 2593-2600. DOI:10.1097/00007890-200006270-00020

[27] Choi HJ, Kim MK, Lee HJ, et al. Effect of αGal on Corneal Xenotransplantation in a Mouse Model[J]. Xenotransplantation, 2011, 18(3): 176-182.

[28] Kim MS, Jeong S, Lim HG, et al. Differences in Xenoreactive Immune Response and Patterns of Calcification of Porcine and Bovine Tissues in α-Gal Knock-out and Wild-type Mouse[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2015, 48(3): 392-399. DOI:10.1093/ejcts/ezu501

[29] Milland J, Christiansen D, Lazarus BD, et al. The Molecular Basis for Galalpha(1, 3)gal Expression in Animals with a Deletion of the Alpha1, 3 Galactosyltransferase Gene[J]. J Immunol, 2006, 176(4): 2448-2454. DOI:10.4049/jimmunol.176.4.2448

[30] Puga Yung GL, Li Y, Borsig L, et al. Complete Absence of the α-Gal Xenoantigen and Isoglobotrihexosyl Ceramide in α1, 3 Galactosyltransferase Knock-out Pigs[J]. Xenotransplantation, 2012, 19(3): 196-206. DOI:10.1111/j.1399-3089.2012.00705.x

[31] Milland J, Christiansen D, Sandrin MS. Alpha1, 3-Galactosyltransferase Knockout Pigs are Available for Xenotransplantation:Are Glycosyltransferases Still Relevant?[J]. Immunol Cell Biol, 200, 83(6): 687-693.

[32] 徐麗明, 邵安良, 范昌發(fā), 等.一種制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法及應(yīng)用[P].專利號(hào): NL 201410313280.1, 授權(quán)公告日: 2018年02月02日, 授權(quán)公告號(hào): CN 104120147A.

[33] 徐麗明, 邵安良, 范昌發(fā).一種制備GGTA1和iGb3S雙基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法及應(yīng)用[P].專利號(hào): ZL201510122581.0, 授權(quán)公布日: 2019年01月18日, 授權(quán)公告號(hào): CN 104894163 B.

[34] Shao A, Xu L, Wu X, et al. Gal Epitope Expression and Immunological Properties in iGb3S Deficient Mice[J]. Scientific Reports, 2018, 8: 15433. DOI:10.1038/s41598-018-33032-7

[35] 邵安良, 魏利娜, 范昌發(fā), 等. 2種Gal抗原缺失小鼠的免疫學(xué)特性比較研究[J]. 藥物分析雜志, 2018, 38(8): 1288-1295.

[36] Shao A, Ling Y, Xu L, et al. Xenogeneic Bone Matrix Immune Risk Assessment Using GGTA1 Knockout Mice[J]. Artificial Cells, Nanomed, and Biotechnol, 2018. DOI:10.1080/21691401

[37] 邵安良, 魏利娜, 范昌發(fā), 等. Gal抗原缺失小鼠的應(yīng)用示范:動(dòng)物源性硬腦膜補(bǔ)片的免疫原性反應(yīng)評(píng)價(jià)[J]. 藥物分析雜志, 2018, 38(8): 1296-1303.

[38] 魏利娜, 邵安良, 黃立靜, 等. 去細(xì)胞異種角膜基質(zhì)與去細(xì)胞異種結(jié)膜基質(zhì)的免疫原性研究[J]. 藥物分析雜志, 2019, 39(8): 1362-1369.

[39] 陳亮, 邵安良, 魏利娜, 等. 應(yīng)用Gal抗原缺失小鼠評(píng)價(jià)可降解異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的免疫原性[J]. 藥物分析雜志, 2019, 39(8): 1370-1378.